研究背景与目的近年来,由于人们饮食和生活习惯的改变,大肠癌的发病率逐年提高,已成为发达国家和地区导致死亡的主要疾病之一。遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)作为大肠癌的一个重要临床亚型,占所有大肠癌的5%-15%,它是由于DNA错配修复(MMR)基因发生胚系突变所致的一种单基因的显性遗传性疾病,又称Lynch综合症。HNPCC的遗传学基础为MMR基因突变。携带该基因突变的人在70岁前发生大肠癌的绝对危险为70%-90%,其他肠外肿瘤发生率也明显升高。目前已克隆出的MMR基因包括hMLH1、hMSH2、hPMS1、hPMS2、hMSH3、hMSH5和hMSH6,其表达产物为错配修复蛋白,是一种核酸水解酶,在DNA的复制过程中水解错配的碱基,从而使DNA能精确地复制,保证人类遗传的保守性和稳定性。如果该基因发生突变,错配修复蛋白的表达量就会下降、不表达或者出现截短,使DNA的复制错误增加和微卫星不稳定(MSI),从而导致大肠癌及其他肠外肿瘤(如子宫内膜癌、卵巢癌、膀胱癌等)的发生。90%以上的突变发生于hMLH1和hMSH2。HNPCC在我国并未引起足够的重视,常常漏诊。因此,正确认识HNPCC的发病特点、遗传学特征以及临床治疗方法对有效防治HNPCC有十分重要的意义。免疫组织化学(IHC)染色和微卫星分析(MSI)常用于HNPCC最初的诊断性筛查。检测该基因的突变是确定HNPCC最根本的标准,具有前瞻性作用,可以在HNPCC病人和家属未发病前了解其发病的危险程度。但是基因突变的检测费用昂贵、费时,很难在临床广泛应用,于是寻找与MMR基因突变相关的新的遗传标记,建立一种取材方便(如取外周血),简单易行,花费小的方法,是目前我国临床确诊HNPCC所亟待解决的问题之一。人类基因组由30亿个核苷酸组成,它们携带着人类的遗传信息并决定人体的生理特性。人类基因组序列的0.1%-0.2%在人种、人群和个体之间存在DNA序列差异,即单核苷酸多态性(SNP),它是人类基因组中最丰富的遗传变异。一般来说,一个SNP位点只有两种等位基因,因此又叫双等位基因。许多的这些单核苷酸多态性可引起不同的遗传性状,即遗传的多态性,如ABO血型位点标记,白细胞HLA位点标记和个体药物代谢差异等。有的SNP位点还会影响基因的功能,从而导致生物性状改变甚至致病。了解这些DNA序列的差异和单核苷酸多态性以及这些差异所表现的意义将对疾病的预测、诊断、预后和预防带来革命性的变化。发现一些与常见疾病相关的SNP多态位点,是揭示人类疾病复杂致病原因的最重要途径之一。因此,作为第三代遗传标记,SNP可成为筛选HNPCC的特异标记,快速、准确发现高危人群。目前大肠癌的治疗方法仍然是手术切除,然后常规给予辅助性化疗以防止癌细胞的转移。针对大肠癌来说最具抗瘤活性的化疗药是5-氟尿嘧啶(5-FU)。由于不同患者对药物的敏感性存在显著的差异,其预后相差甚大,这就要求对不同的肿瘤患者进行个体化用药,以取得最佳治疗效果。近年来通过肿瘤的药物敏感实验方式对临床个体进行前瞻性的化疗指导已在国内外受到较多的重视,可以为患者提供最佳的解决方案,提高生存率和质量。HNPCC是由于MMR基因种系突变所致,而MMR系统参与对各种化疗药物的细胞反应,因此,比较MMR基因缺失与MMR基因完整的大肠癌对化疗药物敏感性的差异,有助于指导临床个体化治疗。因此,本研究在前期研究的基础上,对新收集的193例可疑HNPCC(均≤50岁)病例进行免疫组化及微卫星分析,初步筛查高度可疑患者,然后通过病例对照研究,对高度可疑HNPCC患者进行SNP基因分型检测及关联性分析,发现与HNPCC发病高度相关的SNP位点,最后分别收集MMR基因缺失和MMR基因完整的大肠癌细胞株,分析各细胞株对5-FU敏感性的差异,为临床筛查HNPCC患者及指导用药提供一定的依据。方法1.可疑HNPCC中MMR蛋白的表达运用IHC检测193例可疑HNPCC中hMLH1和hMSH2蛋白表达情况,将蛋白表达异常的病例确定为高度可疑HNPCC病例。2.可疑HNPCC中MSI的检测选取5个微卫星位点BAT25,BAT26,D5S346,D2S123和D17S250,运用PCR-SSCP分析和DHPLC在非变性条件下检测可疑HNPCC的微卫星情况,将高度微卫星不稳定(MSI-H)的病例确定为高度可疑HNPCC病例。3. HNPCC高度相关SNP位点的筛查以205例大肠癌患者为研究对象,其中高度可疑HNPCC 110例,散发性大肠癌患者95例,运用PCR-连接酶反应检测筛选出的hMLH1和hMSH2基因的20个SNPs,利用关联研究方法确定HNPCC高危人群。4.MMR基因缺失大肠癌与5-FU敏感性的相关性收集MMR基因完整大肠癌细胞株SW480、HT29及MMR基因缺失大肠癌细胞株Lovo、HCT116,其中HCT116为MSI-H细胞株,HT29为MSS细胞株,通过四唑盐比色试验(MTT)、平板克隆形成试验,流式细胞术等方法初步研究不同大肠癌细胞株对5-FU敏感性的差异。结果1.可疑HNPCC中MMR蛋白的表达以193例可疑HNPCC(≤50岁)为筛查对象,30例老年大肠癌(>50岁)为对照,运用IHC方法对hMLH1和hMSH2蛋白表达进行分析。193例可疑HNPCC的hMLH1/hMSH2蛋白表达异常的总检出率为29.02%(56/193)；不同年龄段hMLH1/hMSH2表达异常的检出率依次：≤30岁为40.00%(4/10),31-40岁为28.05%(23/82),41-50岁为28.71%(29/101); hMLH1/hMSH2蛋白在右半结肠、左半结肠和直肠表达异常的检出率分别为40.74%(22/54)、32.65%(16/49)和18.89%(17/90)；有家族史的病例hMLH1/hMSH2表达异常的总检出率为46.15%(12/26)；男性患者hMLH1/hMSH2表达异常的检出率为28.85%(30/104),女性患者为29.21%(26/89)；对照组30例老年大肠癌hMLH1/hMSH2表达异常的检出率为6.67%(2/30)。2.可疑HNPCC中MSI的检测对已行IHC的193例可疑HNPCC作为检测对象,40例老年大肠癌(>50岁)作为对照,应用SSCP分析和DHPLC在非变性的条件下检测可疑HNPCC的微卫星情况。27例未检测出结果,余下166例可疑HNPCC中,检出94例MSI-H病例,检出率为56.63%(94/166)；各年龄段的检出率分别为：≤30岁为66.67%(6/9),31-40岁为61.43%(43/70),41-50岁为51.72%(45/87)；40例老年大肠癌MSI-H的检出率为37.5%(15/40)。在56例MMR基因表达异常患者中,检出51例MSI-H患者；在MMR基因表达正常患者中,检出43例MSI-H患者。3. HNPCC高度相关SNP位点的筛查以205例大肠癌患者作为研究对象,其中110例为高度可疑HNPCC即病例组,95例为散发大肠癌患者即对照组,对MMR基因的20个SNPs进行检测,通过关联研究方法发现一个与HNPCC发病高度相关的标签SNPsrs4608577,该位点位于hMSH2基因中,在病例组有67例为原始碱基T,34例为碱基T转换为碱基C,对照组有71例为原始碱基T,15例为碱基T转换为碱基C,其优势比OR值为2.402(OR＞1),95%CI值为1.201-4.804。4.MMR基因缺失大肠癌与5-FU敏感性的相关性5-FU处理MMR基因缺失大肠癌细胞株HCT116 (MSI-H)、Lovo和MMR基因完整大肠癌细胞株SW480、HT29(MSS)48h后,比较四株大肠癌细胞株对5-FU敏感性的差异。MTT结果显示5-FU对四株大肠癌细胞的抑制率依次为HCT116>Lovo>SW480>HT29,并且存在剂量-时间依赖性。平板克隆形成实验显示,四株大肠癌细胞经过5-FU处理48h后的克隆形成率依次为HCT116<Lovo<SW480<HT29。流式细胞术检测显示5-FU处理大肠癌细胞后,细胞周期中S期的比例明显减少,存在S期阻滞,HT29细胞株的生长分数高于Lovo细胞株。结论1.MMR蛋白异常表达与年龄及家族史密切相关,并且以hMLH1表达异常为主,表明MMR蛋白异常表达是诱发低龄大肠癌的重要因素。2. MSI-H与较早的发病年龄呈现出一致性,≤50岁的低龄大肠癌患者都应作为筛选HNPCC的对象。IHC与MSI二者结合对提高HNPCC的早期诊断率有很重要的意义。3. hMSH2基因的标签SNP位点rs4608577与HNPCC的发生高度相关,该位点碱基T的转换或颠换可能是发生HNPCC的危险因素。表明rs4608577可能成为临床筛查HNPCC的重要遗传标记,与传统检测方法相比,具有简便、易行、快速等优点。4.MMR基因缺失大肠癌对5-FU的敏感性高于MMR基因完整大肠癌,并且MSI-H大肠癌对5-FU的敏感性明显高于MSS大肠癌。提示临床针对MMR基因缺失及MSI-H大肠癌患者利用5-FU进行化疗可能获得较好的治疗效果。