恶性肿瘤已经成为危害人类健康的严重疾病,目前临床应用的抗肿瘤药物虽具有一定的疗效,但其存在选择性低、毒副作用大、容易发生耐药性等缺点,因此开发新的既有抗肿瘤作用且毒副作用更低的药物迫在眉睫。从传统中药中分离提取具有抗肿瘤活性的天然成分是开发新型抗肿瘤药物的一种重要途径,由此途径获得的天然成分在肿瘤治疗中具有疗效确切、毒副作用低、不易产生耐药性等优点,具有广阔的开发前景。壁虎是我国治疗肿瘤的传统中药材,大量的基础和临床研究表明中药壁虎有明确的抗肿瘤作用,对消化道肿瘤的治疗效果更为显著,但是关于壁虎抗癌活性组分的研究报道较少。本研究的目的是从壁虎中分离纯化出具有抗肿瘤的小分子活性组分,初步探讨其抗肿瘤的机制,为壁虎抗肿瘤天然组分的研发和进一步的临床应用提供实验和理论依据。第一部分:壁虎活性组分的分离与纯化目的:本研究是为了从壁虎提取分离出具有抗肿瘤活性的小分子组分,并对其进行纯化和活性筛选。方法:本实验选用新鲜干燥的多疣壁虎,研磨至细粉,经胶体磨匀浆、取水溶液的沉淀物、加55%乙醇提取,离心收集上清,旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥后得到金黄色的壁虎醇提物;将醇提物用超滤管超滤截留,获得小于3000Da的组分;葡聚糖凝胶G-25分离壁虎超滤物,选取活性最好组分使用羟丙基葡聚糖LH-20进一步分离。每一步分离所得组分以抑制人食管癌Ec 9706细胞、人前列腺癌DU145细胞、人肝癌SMMC 7721细胞、人子宫颈癌SiHa细胞增殖情况为作为活性筛选指标。结果:1.CCK8法对壁虎醇提物超滤成分的活性筛选结果发现,超滤物作用24h和48h可显著抑制DU145、Ec 9706、SMMC 7721、SiHa细胞增殖,其中对Ec9706细胞的抑制作用最强,24h和48h的IC₅₀为1.21 mg/mL和1.04 mg/mL。2.经过葡聚糖凝胶G-25分离壁虎超滤物后得到3个活性峰,通过活性筛选后发现峰3的活性最好,峰3作用24h和48h后,DU145、Ec 9706、SMMC7721、SiHa细胞增殖显著降低,发现峰3对Ec 9706细胞抑制作用最强,在24h和48h的IC₅₀为0.92 mg/mL和0.36mg/mL。3.将G-25峰3用LH-20分离,按时间段分段收集,得到20个中间组分,分别进行抗肿瘤活性筛选,发现第15号组分抗肿瘤活性最好,其24h和48h的IC₅₀分别为70.2μg/mL和54.6μg/mL。结论:1.本实验通过水沉醇提、超滤管超滤截留和凝胶色谱柱等方法从壁虎中分离纯化出小于3 k Da的活性组分（LH-20-15）,通过蛋白纯化系统和高效液相等方法初步确定其主要成分为多肽。2.各步分离中间产物对4种肿瘤细胞具有明显的抗癌活性,以人食管癌Ec9706细胞最为敏感。第二部分:LH-20-15通过MACC1/c-Met通路影响人食管癌细胞Ec 9706的增殖与凋亡目的:研究LH-20第15号样品（LH-20-15）对人食管癌细胞Ec 9706增殖与凋亡的影响及其对MACC1/c-Met通路调控作用,为中药壁虎抗肿瘤活性成分的应用提供实验依据和理论基础。方法:采用CCK8和Ed U掺入法检测不同浓度的LH-20-15对Ec 9706细胞增殖的影响;利用流式细胞仪检测LH-20-15的不同浓度下Ec 9706细胞的凋亡率;采用Hoechst 33258染色法观察不同浓度的LH-20-15对Ec 9706细胞凋亡形态学的影响;使用分光光度法检测给予不同浓度的LH-20-15后,Ec 9706细胞内Caspase 3酶活力的变化;采用Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2、Bax和MACC1/c-Met通路相关蛋白的表达情况;使用免疫细胞化学法检测Ec 9706细胞内MACC1蛋白表达情况。结果:1.CCK8结果显示不同浓度的LH-20-15对人食管癌细胞株Ec 9706细胞增殖有明显的抑制作用。经0.3μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL的LH-20-15作用后,Ec 9706细胞增殖抑制率分别为13.8%、20.5%、28.2%、34.1%、42.6%、58.9%、89.9%,具有一定的剂量依赖性。2.Ed U掺入法实验结果显示,对照组细胞呈棕色深染,细胞增殖能力强;而与对照组相比,随着给药浓度的逐渐增加,Ec 9706细胞棕染逐渐降低,表明LH-20-15组细胞DNA合成逐渐受到抑制。3.流式细胞仪结果表明,当药物LH-20-15浓度为0.1μg/mL时,Ec 9706细胞凋亡率为17.5%,与对照组相比,差异无统计学意义;0.3μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL的LH-20-15对Ec 9706细胞凋亡率分别为28.4%、35.7%、50.6%、54.6%、61.4%、84.3%。4.Hoechst 33258荧光染色结果发现,对照组细胞形态正常,细胞核呈均匀的蓝色;随着LH-20-15浓度的增加,细胞核呈高亮荧光,表明LH-20-15组凋亡细胞数目增多。5.Caspase 3活性检测结果表明,与对照组相比,给予0.1μg/mL、0.3μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL的LH-20-15作用48 h后,Ec 9706细胞内Caspase 3酶活力水平均显著增加,差异均有统计学意义。6.Western Blot结果显示,与对照组相比,LH-20-15低、中、高剂量组（15、30、60μg/mL）均可明显升高Bax、p-Bad、Caspase 3的表达并降低MACC1、p-c-Met、p-Akt、Bcl-2蛋白的表达,差异有统计学意义。7.免疫细胞化学结果发现,对照组MACC1表达水平较高,细胞阳性染色率高;与对照组相比,LH-20-15低、中、高剂量组（15、30、60μg/mL）MACC1阳性着色明显降低,表明LH-20-15各组均能显著抑制MACC1蛋白的表达。结论:LH-20-15可以显著抑制食管癌Ec 9706细胞增殖,并且诱导细胞凋亡,其机制可能是通过影响线粒体凋亡通路和MACC1/c-Met通路相关蛋白表达,从而抑制Ec 9706细胞增殖,诱导细胞凋亡有关。