ATP-结合盒（ATP-binding cassette,ABC）超家族转运体广泛的分布于细菌、真菌和真核生物体内,能够利用水解ATP产生的能量逆浓度梯度转运从小分子到较大化合物的各种底物。ABC家族转运体是引起人类肿瘤细胞耐药和细菌耐药的一个重要因素。大肠埃希氏菌（Escherichia coli）K-12菌株基因组预测编码11个ABC家族外排转运体,其中,YbhFSR和YddA被推测为药物外排转运体,但其确切功能尚缺乏实验研究。对细菌ABC家族预测药物外排转运体功能的研究对于了解细菌的耐药性乃至解读人类肿瘤的耐药性机制具有重要意义。本研究首先对E.coli YbhFSR和YddA转运体进行系统的生物信息学分析。分析显示,YbhFSR转运体由三个独立的蛋白质YbhF、YbhS和YbhR组成,YbhF蛋白属于ABC家族核苷酸结合结构域,YbhS和YbhR属于ABC家族的跨膜结构域。YddA转运体NH₂-端为5个α-螺旋基序构成的跨膜结构域,COOH-端为ABC家族核苷酸结合结构域。为研究YbhFSR和YddA转运进功能,利用Red重组技术分别构建了基因敲除菌株E.coliΔybhF、E.coliΔybhR、E.coliΔybhS、E.coliΔybhSR、E.coliΔybhFSR、E.coliΔacr B和E.coliΔacrBΔybhF;此外构建了ybhF过表达菌株E.coli/pET28a-ybhF。为研究YddA转运体功能,构建了yddA敲除菌株E.coliΔyddA、E.coliΔyddAΔacrB和E.coliΔyddB。通过孔雀绿试验方法研究了纯化的YbhF蛋白的ATPase活性。结果显示,与对照空质粒菌株纯化蛋白相比,过表达菌株YbhF蛋白ATP酶活性显著高于对照组,YbhF蛋白具有ABC家族的核苷酸结合结构域,能够利用水解ATP释放能量转运底物。以溴化乙锭（ethidium bromide,EB）为底物检测YbhFSR转运体及YddA转运体的外排能力,结果显示,与对照菌株E.coli/pET28a相比,过表达菌株E.coli/pET28a-ybhF具有增强EB外排的能力,而基因敲除菌株E.coli?acrB、E.coli?ybhF和E.coli?acrB?ybhF外排EB能力均降低,特别是E.coliΔacrBΔybhF外排EB能力降低最明显。E.coliΔyddA的EB外排能力明显降低。以上结果表明YbhFSR及YddA转运体都具有外排EB的能力,YbhFSR和YddA转运体属于ABC家族的外排转运体。通过药物敏感性实验筛选YbhFSR及YddA转运体可能外排的底物。结果显示,YbhFSR转运体只对四环素、土霉素、金霉素和强力霉素四种四环素类药物以及外排泵通用阳离子底物EB和Hoechst33342具有敏感性,以上结果表明YbhFSR转运体属于四环素类药物单药外排转运体。而YddA转运体对20种药物中的13种具有敏感性,表明YddA转运体是多药外排转运体。利用四环素类药物和喹诺酮类药物自发荧光的性质,研究了药物在细胞内的积累和外排情况。结果表明,E.coli?acrB、E.coli?ybhF和E.coli?acrB?ybhF三株细菌四环素类药物外排能力降低,同时四环素类药物在细胞内积累增加;E.coliΔyddA外排诺氟沙星的能力显著降低,诺氟沙星在胞内积累增加。为进一步证实两种转运体的药物外排作用和能量来源,实验中分别使用了三种抑制剂（原矾酸盐、CCCP和利血平）及其它已知多药外排泵底物。结果显示,YbhFSR外排四环素能力受到原矾酸盐和CCCP的显著抑制,YbhFSR转运体的能量来源是ATP。YddA转运体外排诺氟沙星的能力受到原矾酸盐和利血平显著抑制,同时也能被其它已知多药外排泵底物抑制,表明YddA转运体的能量来源是ATP,且能够识别和转运多个底物。实验进一步将pET28a-ybhF和pET28a空质粒转入E.coli Na⁺缺陷型菌株KNabc中,过表达ybhF赋予了KNabc菌株对NaCl、LiCl和碱性pH的耐受性,证明YbhF具有Na⁺（Li⁺）/H⁺逆向转运功能。上述结果表明,E.coli的YbhFSR是ABC家族的单药外排转运体,可发挥四环素类药物外排和Na⁺（Li⁺）/H⁺逆向转运的双重作用。YddA转运体是ABC家族的多药外排转运体。