目的:本研究通过放射性核素⁹⁹Tc^m标记Z_HER2:V2亲和体制备分子影像探针,应用单光子计算机断层成像仪（single photon emission computed tomography,SPECT）对乳腺癌HER2不同表达水平的荷瘤裸鼠模型进行显像对比研究,探索⁹⁹Tc^m标记Z_HER2:V2分子探针检测HER2高表达乳腺癌的可行性。测定⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针室温静置20min的放化纯,评价其体内外稳定性;观察该探针在HER2高表达人乳腺癌BT474细胞（1²×10 6 HER2 receptors/cell）与HER2低表达人乳腺癌MDA-MB-231细胞（4×104 HER2 receptors/cell）的摄取、滞留、内化、阻断情况,以了解该分子探针在体外的药代动力学及特异性;应用⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针对人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型进行体内分布研究,分析该探针在荷瘤裸鼠体内各器官的分布及其对肿瘤组织的靶向性;应用SPECT对以上两种肿瘤细胞构建的荷瘤裸鼠模型进行显像对比研究;通过免疫组织化学（Immunohistochemistry IHC）技术分析实验所用的BT474及MDA-MB-231肿瘤细胞及BT4747荷瘤裸鼠及MDA-MB-231荷瘤裸鼠肿瘤组织内的HER2表达情况,探讨⁹⁹Tc^m标记Z_HER2:V2分子影像探针对HER2高表达乳腺癌的诊断价值。方法:1分子探针的合成:通过Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZHER2:V2亲和体,并在其C末端连接1个由4个氨基酸（-G（Gly）GGC（Cys））组成的类似N3S结构的短肽,作为该分子探针的双功能螯合剂（Bi-Functional Chelating Agent,BFCA）,并利用配体交换法与核素99Tcm进行标记。2分子探针的标记率:应用反相高效液相色谱法（reverse-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）测定⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针的标记率。3体外稳定性测定:将该分子探针分别与生理盐水及人新鲜血清等体积混合,并于恒温水浴环境中（37℃）孵育1、2、4、6、12、24h,并应用RP-HPLC法分别测定其在以上各时间点该两种介质中的放化纯。4细胞培养:采用静置贴壁法培养人乳腺癌bt474肿瘤细胞以及人乳腺癌mda-mb-231肿瘤细胞,收集处于对数生长期的该两种细胞用于实验。5细胞摄取、滞留、内化、阻断实验:将人乳腺癌bt474肿瘤细胞和人乳腺癌mda-mb-231肿瘤细胞分别以6×105个/孔的密度接种于六孔板内,在培养箱中培养48h达到单层亚融合状态时进行细胞的摄取、滞留、内化及阻断实验,研究该分子探针在上述bt474细胞以及mda-mb-231细胞中的细胞摄取、滞留、内化及阻断情况,以了解该分子探针在体外的药代动力学及特异性。6构建荷瘤裸鼠模型:将人乳腺癌bt474肿瘤细胞以及人乳腺癌mda-mb-231肿瘤细胞分别接种于无特定病原体（specificpathogenfree,spf）级balb/c裸鼠右前肢外侧皮下,待肿瘤直径长置约1.0cm满足实验要求时,即建模成功。取同种肿瘤大小无明显差异,外观饱满、红润、无坏死的荷瘤裸鼠用于实验。7体内稳定性检测:收集尾静脉注入⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针后1.5²h内的尿液,应用rp-hplc法测定尿液中的放射性化学纯度。8体内分布实验:取16只人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠模型,利用随机数字表法等分为4组,经尾静脉注射⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针后1、2、4、6h取一组动物模型,眼静脉取血后,颈椎脱臼处死,即刻取出其肾、肝、心、脾、胃、肺、小肠、血液、肌肉、骨骼、脑、肿瘤,称重并测定其相应器官或组织的放射性计数,测定标准源（n=3）的放射性计数后,计算出每克组织中的放射性计数与标准源的比值,即每克组织的百分注射剂量率（percentageactivityofinjectiondosepergramoftissue,%id/g）以及肿瘤与肌肉组织的%id/g比值（tumortomuscle,t/m）。研究各时间点该分子探针在人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠动物模型的体内分布情况。9荷瘤裸鼠显像:取her2高表达人乳腺癌bt474荷瘤裸鼠以及her2低表达人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠模型各5只,经尾静脉注射⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针,于注药后1、2、4、6h行spect静态显像,观察各组内肿瘤部位放射性浓聚情况随时间的变化以及同一显像时间点两组间不同荷瘤裸鼠肿瘤部位放射性浓聚的差异;另再取人乳腺癌bt474荷瘤裸鼠及mda-mb-231荷瘤裸鼠各1只,在注射⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针前,注射过量未标记核素的zher2:v2亲和体后同样按照1、2、4、6h行spect静态显像,进行阻断特异性研究,观察同组内肿瘤部位不同时间的放射性浓聚情况以及同种荷瘤裸鼠模型阻断与未阻断之间同一时间点浓聚情况的不同。10病理学检测:对本实验所用的人乳腺癌bt474肿瘤细胞、人乳腺癌mda-mb-231肿瘤细胞和bt474荷瘤裸鼠肿瘤组织、mda-mb-231荷瘤裸鼠的肿瘤组织做免疫组织化学染色（immunohistochemistry）来检测her2的表达情况。11统计学处理:本研究所有计量资料实验数据均以均数±标准差（x±s）表示,采用spss21.0统计软件进行统计学分析。对两组间实验数据进行两样本t检验（或t’检验）或wilcoxon秩和检验;每组内实验数据多重比较采用one-wayanova中的s-n-k法或非参数检验中的krustal-wallish检验。以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针的质量控制:分子探针放射峰保留时间为13.68min,室温静置20min测其放化纯为（99.49±0.01）%（n=6）。该分子探针在生理盐水及人新鲜血清中孵育24h内的放化纯均在91%以上,且放射峰的位置稳定,与孵育前相比未见明显漂移;hplc法测得注射分子探针后1.5-2h荷瘤裸鼠的尿液,主峰的放化纯仍为94.78%,仅小部分在体内代谢。2细胞实验:1)摄取实验:人乳腺癌her2高表达bt474肿瘤细胞在1、2、4、6、12、24h各时间点的摂取率分别为（4.86±0.60）%、（5.62±0.37）%、（44.18±6.40）%、（60.85±1.51）%、（58.76±6.32）%、（58.35±2.08）%,人乳腺癌mda-mb-231肿瘤细胞在以上各时间点的细胞摂取率分别为（2.46±2.60）%、（3.75±0.71）%、（3.80±1.60）%、（5.38±1.21）%、（4.29±1.60）%、（3.56±0.60）%。人乳腺癌her2高表达bt474细肿瘤胞各时间点的摄取率均明显高于人乳腺癌her2低表达mda-mb-231肿瘤细胞（t=4.037⁵9.169,均p<0.05）,且两者整体呈上升趋势,至6h达到最大值,之后保持稳定,达到一个平台期。2)滞留实验:分子探针在该两种肿瘤细胞内滞留率均较高,bt474及mda-mb-231细胞1h的滞留率分别可达到（89.74±2.48）%、（74.31±1.31）%,各时间点的滞留率bt474肿瘤细胞均高于mda-mb-231肿瘤细胞,且1-6小时下降较快,之后随时间延长滞留率下降缓慢,并逐渐保持在一个相对稳定的水平。3)内化实验:随着时间延长内化率整体呈上升趋势,bt474肿瘤细胞各时间点的内化率明显高于mda-mb-231细胞。4)阻断实验:bt474肿瘤细胞与mda-mb-231肿瘤细胞在加入⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针之前,分别加入500倍及1000倍过量的未标记核素的zher2:v2亲和体对her2靶点进行阻断、封闭,bt474肿瘤细胞及mda-mb-231肿瘤细胞的4h摄取率及被500倍、1000倍未标记核素的亲和体阻断后的细胞摄取率分别为（44.18±6.40）%、（5.28±2.33）%、（2.29±0.83）%;（3.67±0.73）%、（1.90±1.00）%、（1.21±0.48）%。两种肿瘤细胞阻断后的细胞摄取率与未阻断前相比均显著下降（f=104.524,p<0.05;f=9.063,p<0.05）。3荷瘤裸鼠体内分布:除肾脏外,⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针在人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠肿瘤组织内分布较高,在1、2、4、6h肿瘤组织的%id/g（均数±标准差）分别为（1.73±0.17）、（1.94±0.13）、（3.11±0.11）、（2.56±0.12）,在4h达到峰值;探针经肾脏排泄,在肾脏部位的聚集随着时间的延长,排泄迅速,由1h的（6.46±1.01）下降到6h的（2.14±0.41）。此外,⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针在其余正常组织或器官中均浓聚不明显,且随着时间的延长,浓聚呈下降趋势。4荷瘤裸鼠spect显像:人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠注射⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子探针1h肿瘤组织即有明显的放射性核素摄取,且随时间的延长浓聚程度逐渐增加,4h达摄取高峰,6h稍见降低;人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠在注射该分子探针后1h肿瘤部位可见轻度放射性核素摄取,4h时显影较明显,之后稍降低,各时间点肿瘤部位放射性浓聚程度均明显低于bt474荷瘤裸鼠。各时间点t/nt比值bt474荷瘤裸鼠模型组明显高于mda-mb-231荷瘤裸鼠模型组（t=23.023²6.314,t′=-22.808,z=-2.887,p<0.05）。阻断组人乳腺癌bt474荷瘤裸鼠与人乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠肿瘤部位的t/nt比值均较未阻断组明显下降（t′=27.838³0.343,Z=-2.882,P<0.05;t=7.704⁸.864,t′=8.896,Z=-2.882,P<0.05）。5病理学分析:人乳腺癌BT474荷瘤裸鼠肿瘤组织免疫组织化学染色为强阳性（++++）,而人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠肿瘤组织免疫组织化学染色为弱阳性（﹣或+）。人乳腺癌BT474细胞免疫组织化学染色为强阳性（++++）,而人乳腺癌MDA-MB-231细胞免疫组织化学染色为阴性或者弱阳性（﹣或+）。结论:⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2分子影像探针的标记方法简便,标记率高,无需进一步纯化即可用于显像,且体内外稳定性好,能够被HER2高表达人乳腺癌BT474肿瘤细胞以及BT474荷瘤裸鼠肿瘤组织特异性摄取,且该探针经肾脏排泄,显像本底较低。综上,⁹⁹Tc^m-Z_HER2:V2有望成为检测HER2高表达乳腺癌的分子影像探针。