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研究目的:
神经病理性疼痛是指由于周围或者中枢神经系统出现的原发和继发性损害而导致的一种自发性、持续性的慢性疼痛。表现为自发性疼痛、异常痛觉过敏甚至超敏反应。背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)是传入感觉神经元的胞体主要聚集部位，影响背根神经节部位神经元的活性能够改变神经信号的传导。Proviral integration site1(PIM1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族一员，其在背根神经内的表达及其可能的作用仍未见报道。因此，探索PIM1对背根神经节内神经元的兴奋性的影响对于阐明神经病理性疼痛的发病机制具有重要的意义，为治疗神经病理性疼痛的药物研发提供潜在的治疗靶点。
研究方法:
第一部分:明确神经病理性疼痛时背根神经节PIM1的分布及时程性表达变化趋势。(1).利用L4脊神经结扎术(spinal nerve ligation，SNL)建立神经病理性疼痛模型，探索PIM家族mRNA表达水平的变化。(2).检测小鼠疼痛模型中L4背根神经节内PIM1mRNA和蛋白的时程性表达变化趋势。(3).利用免疫荧光染色明确PIM1在背根神经节内不同细胞之间的定位表达情况。
第二部分:抑制DRG中PIM1的表达对小鼠神经病理性疼痛行为学的影响。(1).利用neuro-2a细胞系筛选抑制PIM1的基因序列。(2).利用DRG微注射技术结合腺相关病毒实现在体抑制L4背根神经节内PIM1的表达，观察在体抑制L4DRG中PIM1的水平对SNL术建立神经病理性疼痛模型小鼠的机械刺激缩足百分比、热刺激缩足潜伏期、冷刺激缩足潜伏期的影响。
第三部分:探索抑制DRG中PIM1参与调节神经病理性疼痛的作用机制。(1).免疫荧光染色明确PIM1与CXC型趋化因子受体4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)的共标情况。(2).体内/体外研究明确PIM1对CXCR4及磷酸化CXCR4(ser339)的蛋白水平的影响。(3).共聚焦显微镜明确PIM1抑制剂SMI-4a对CXC型趋化因子配体12(CXC chemokine ligand12，CXCL12与CXCR4的结合水平的影响。
研究结果:
1.与Sham组相比，脊神经结扎术后小鼠术侧L4DRG组织中PIM1mRNA的表达水平显著增加，PIM2mRNA表达水平降低，PIM3mRNA水平未见明显差异。
2.与0天相比，L4脊神经结扎术后3天、7天以及14天小鼠术侧L4DRG组织中PIM1蛋白水平持续增加，然而Sham组小鼠各个时间点的PIM1蛋白水平未见显著改变。然而，与0天相比，Sham组或者SNL手术组小鼠的术后各个时间点的L3DRG组织中PIM1蛋白水平均未见显著改变。
3.免疫荧光染色显示:在背根神经节内，PIM1表达在NeuN+的神经元内，而非GS+卫星胶质细胞内;在DRG组织中，PIM1阳性的神经元中约46％PIM1+的神经元为小神经元(截面积为0-300μm2)，约30％PIM1+的神经元为中等大小神经元(截面积为300-600μm2)，约24％PIM1+的神经元为大神经元(截面积为600-2000μm2);此外，在DRG组织中，PIM1阳性的神经元中约22.8％为降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)阳性，14.6％为P物质(P substance，SP)阳性，32.4％为凝集素B4(Isolectin B4，IB4)阳性。
4.背根神经节微注射pAAV-shPIM1病毒，能够在体抑制脊神经结扎术导致的背根神经节PIM1蛋白水平上调的表达趋势。此外，与SNL+Scramble组相比，背根神经节微注射pAAV-shPIM1病毒，能够在体逆转L4脊神经结扎术导致的小鼠术侧疼痛行为学的改变。包括:降低机械刺激缩足百分率，升高热刺激缩足潜伏期和冷刺激缩足潜伏期。然而，各组小鼠非术侧足底对上述刺激均未见明显改变。
5.免疫荧光染色显示:在背根神经节内，PIM1与CXCR4共表达于神经元内;体外研究发现，过表达PIM1显著增加磷酸化CXCR4(ser339)蛋白的表达水平，但对于CXCR4蛋白水平未见显著影响;敲低PIM1的表达水平，显著抑制磷酸化CXCR4(ser339)的蛋白表达水平，但对于CXCR4蛋白表达水平未见显著影响。体内研究发现，背根神经节微注射pAAV-shPIM1病毒显著抑制L4脊神经结扎术导致的磷酸化CXCR4(ser339)的蛋白表达水平，但对于CXCR4的蛋白水平未见显著影响。此外，激光共聚焦显微镜显示:在neuro-2α细胞系中，PIM1抑制剂SMI-4a能够显著抑制CXCL12与CXCR4的结合转入细胞内的比例。
研究结论:
L4脊神经结扎术后，L4背根神经节神经元内PIM1的蛋白表达水平显著升高，参与神经病理性疼痛的发生和维持。抑制PIM1可能通过调控CXCL12/CXCR4途径改善脊神经结扎术导致的神经病理性疼痛。研究提示:PIM1可能成为治疗神经病理性疼痛的药物治疗的潜在作用靶点。
神经病理性疼痛是指由于周围或者中枢神经系统出现的原发和继发性损害而导致的一种自发性、持续性的慢性疼痛。表现为自发性疼痛、异常痛觉过敏甚至超敏反应。背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)是传入感觉神经元的胞体主要聚集部位，影响背根神经节部位神经元的活性能够改变神经信号的传导。Proviral integration site1(PIM1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族一员，其在背根神经内的表达及其可能的作用仍未见报道。因此，探索PIM1对背根神经节内神经元的兴奋性的影响对于阐明神经病理性疼痛的发病机制具有重要的意义，为治疗神经病理性疼痛的药物研发提供潜在的治疗靶点。
研究方法:
第一部分:明确神经病理性疼痛时背根神经节PIM1的分布及时程性表达变化趋势。(1).利用L4脊神经结扎术(spinal nerve ligation，SNL)建立神经病理性疼痛模型，探索PIM家族mRNA表达水平的变化。(2).检测小鼠疼痛模型中L4背根神经节内PIM1mRNA和蛋白的时程性表达变化趋势。(3).利用免疫荧光染色明确PIM1在背根神经节内不同细胞之间的定位表达情况。
第二部分:抑制DRG中PIM1的表达对小鼠神经病理性疼痛行为学的影响。(1).利用neuro-2a细胞系筛选抑制PIM1的基因序列。(2).利用DRG微注射技术结合腺相关病毒实现在体抑制L4背根神经节内PIM1的表达，观察在体抑制L4DRG中PIM1的水平对SNL术建立神经病理性疼痛模型小鼠的机械刺激缩足百分比、热刺激缩足潜伏期、冷刺激缩足潜伏期的影响。
第三部分:探索抑制DRG中PIM1参与调节神经病理性疼痛的作用机制。(1).免疫荧光染色明确PIM1与CXC型趋化因子受体4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)的共标情况。(2).体内/体外研究明确PIM1对CXCR4及磷酸化CXCR4(ser339)的蛋白水平的影响。(3).共聚焦显微镜明确PIM1抑制剂SMI-4a对CXC型趋化因子配体12(CXC chemokine ligand12，CXCL12与CXCR4的结合水平的影响。
研究结果:
1.与Sham组相比，脊神经结扎术后小鼠术侧L4DRG组织中PIM1mRNA的表达水平显著增加，PIM2mRNA表达水平降低，PIM3mRNA水平未见明显差异。
2.与0天相比，L4脊神经结扎术后3天、7天以及14天小鼠术侧L4DRG组织中PIM1蛋白水平持续增加，然而Sham组小鼠各个时间点的PIM1蛋白水平未见显著改变。然而，与0天相比，Sham组或者SNL手术组小鼠的术后各个时间点的L3DRG组织中PIM1蛋白水平均未见显著改变。
3.免疫荧光染色显示:在背根神经节内，PIM1表达在NeuN+的神经元内，而非GS+卫星胶质细胞内;在DRG组织中，PIM1阳性的神经元中约46％PIM1+的神经元为小神经元(截面积为0-300μm2)，约30％PIM1+的神经元为中等大小神经元(截面积为300-600μm2)，约24％PIM1+的神经元为大神经元(截面积为600-2000μm2);此外，在DRG组织中，PIM1阳性的神经元中约22.8％为降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)阳性，14.6％为P物质(P substance，SP)阳性，32.4％为凝集素B4(Isolectin B4，IB4)阳性。
4.背根神经节微注射pAAV-shPIM1病毒，能够在体抑制脊神经结扎术导致的背根神经节PIM1蛋白水平上调的表达趋势。此外，与SNL+Scramble组相比，背根神经节微注射pAAV-shPIM1病毒，能够在体逆转L4脊神经结扎术导致的小鼠术侧疼痛行为学的改变。包括:降低机械刺激缩足百分率，升高热刺激缩足潜伏期和冷刺激缩足潜伏期。然而，各组小鼠非术侧足底对上述刺激均未见明显改变。
5.免疫荧光染色显示:在背根神经节内，PIM1与CXCR4共表达于神经元内;体外研究发现，过表达PIM1显著增加磷酸化CXCR4(ser339)蛋白的表达水平，但对于CXCR4蛋白水平未见显著影响;敲低PIM1的表达水平，显著抑制磷酸化CXCR4(ser339)的蛋白表达水平，但对于CXCR4蛋白表达水平未见显著影响。体内研究发现，背根神经节微注射pAAV-shPIM1病毒显著抑制L4脊神经结扎术导致的磷酸化CXCR4(ser339)的蛋白表达水平，但对于CXCR4的蛋白水平未见显著影响。此外，激光共聚焦显微镜显示:在neuro-2α细胞系中，PIM1抑制剂SMI-4a能够显著抑制CXCL12与CXCR4的结合转入细胞内的比例。
研究结论:
L4脊神经结扎术后，L4背根神经节神经元内PIM1的蛋白表达水平显著升高，参与神经病理性疼痛的发生和维持。抑制PIM1可能通过调控CXCL12/CXCR4途径改善脊神经结扎术导致的神经病理性疼痛。研究提示:PIM1可能成为治疗神经病理性疼痛的药物治疗的潜在作用靶点。