论文部分内容阅读
研究背景和目的:1999年,Maniotis首次提出了血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)的概念,一种不依赖机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式。在随后的研究中发现肝癌、前列腺癌、卵巢癌及一些双向分化肿瘤中同样存在VM。具有VM的肿瘤多恶性程度高,易发生血道转移,临床预后差。目前的研究普遍认为肿瘤细胞的塑形性是VM形成的关键环节,但相关机制还尚未完全明确。已有研究表明上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在VM形成中发挥着重要作用。EMT是指上皮细胞在特定的生理或病理情况下向间充质细胞转分化的现象,是受到精确的细胞信号转导机制调控的复杂过程。Wnt/β-catenin是参与调控EMT的重要信号通路之一。然而,目前关于Wnt/β-catenin信号通路在VM形成中的作用仍不清楚。大多数结肠癌都存在Wnt/β-catenin信号通路的异常活化,且前期研究已发现在结肠癌组织中存在VM。本研究利用免疫组化技术初步分析了217例结肠癌病例组织中Wnt/β-catenin信号通路的活化状态与结肠癌细胞EMT及VM形成的关系,并利用细胞转染技术及免疫缺陷小鼠肿瘤细胞移植瘤模型进一步证实了Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子Dkk1对结肠癌细胞EMT及VM形成的影响,阐明Wnt/β-catenin信号通路在VM形成过程中的可能作用机制,深化对肿瘤细胞分化功能的认识,为临床肿瘤抗血管生成治疗提供新的思路和靶点。研究方法:1) H&E染色及CD34-PAS双重染色方法检测217例人结肠癌组织中VM。2)免疫组化方法检测Wnt/β-catenin通路调控蛋白β-catenin, Dickkopf-1(Dkkl)及EMT标记蛋白E-cadherin, Vimentin的表达,初步分析Wnt/β-catenin通路活化状态对结肠癌EMT的影响及Wnt/β-catenin通路与VM的相关性。3)转染并筛选出稳定过表达Dkkl的人结肠癌HCT116细胞,验证Dkk1及Wnt/β-catenin通路下游信号分子表达情况。4) MTT和软琼脂克隆形成实验检测Dkkl对细胞增殖能力的影响。5)划痕、粘附、体外侵袭实验检测Dkk1对结肠癌细胞运动、癌细胞与细胞外基质之间粘附及侵袭能力的影响。6)体外三维培养((?)three dimensional culture,3D)观察Dkk1对结肠癌细胞管状结构形成能力的影响。7)检测Dkkl过表达后EMT相关蛋白、VM形成相关蛋白及结肠癌干样细胞相关蛋白表达情况,探讨Wnt/β-catenin信号通路调控结肠癌细胞VM形成的分子机制。8)将稳定过表达Dkkl的HCT116细胞接种到裸鼠体内,观察Dkk1在体内对结肠癌细胞增殖、侵袭能力的影响,免疫组化检测肿瘤组织内EMT相关蛋白的表达和VM形成情况,进一步明确在结肠癌中抑制Wnt/β-catenin信号通路对VM形成的影响。结果:1)人结肠癌组织中存在VM,且存在VM的肿瘤组织分化较差、临床分期高并易发生转移、复发(P<0.05);2)存在VM的结肠癌组织中肿瘤细胞高表达Vimentin,低表达E-cadherin(P<0.05),提示存在VM的结肠癌组织中肿瘤细胞多发生EMT;Wnt/β-catenin信号通路活化的肿瘤细胞更易发生EMT;存在VM的结肠癌组织中β-catenin核表达较高,而Dkk1表达相对较低(P<0.05),提示Wnt/β-catenin信号通路活化的结肠癌组织更易发生VM。3)转染Dkkl的HCT116细胞Dkk1表达增加,c-myc和cyclinD1表达降低。4)Dkk1过表达抑制HCT116细胞的增殖(P<0.05)。5)Dkk1过表达的HCT116细胞修复划痕能力明显减弱(P<0.05),粘附能力明显增加(P<0.05),侵袭能力明显减弱(P<0.05)。6)Dkk1过表达的HCT116细胞形成管状结构能力比对照组细胞明显减弱。7)Dkk1过表达的HCT116细胞与对照组细胞相比E-cadherin、Keratinl8表达升高,Vimentin, Fibronectin,β-catenin, Snail, Twist, VE-cadherin, Lgr5,CD133表达降低。8)接种了Dkk1过表达HCT116细胞的小鼠与对照组小鼠相比肿瘤生长较慢(P<0.05),成瘤能力降低;肿瘤组织E-cadherin表达增加,Vimentin和β-catenin表达降低,形成VM数量减少。结论:1)结肠癌组织中存在VM,且VM的存在与肿瘤细胞EMT及Wnt/β-catenin信号通路的活化状态相关。2) Wnt/β-catenin信号通路抑制因子Dkk1抑制结肠癌细胞EMT,影响肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭并抑制VM形成。