论文部分内容阅读
子痫前期是影响全世界妊娠期产妇妊娠不良结局的主要因素,严重威胁母婴健康,而且目前临床医学研究尚未解决这一问题,近年来子痫前期的发病率呈现逐年上升的趋势,有效的预防与治疗子痫前期,改善妊娠期孕妇的患病风险,提高孕妇与胎儿的出生率与存活率,已经成为当代妇产科医学研究着重解决的当务之急。子痫前期可能是由表观遗传修饰改变导致的不良子宫环境造成的,包括DNA甲基化和去甲基化的失调。已有研究表明子痫前期患者胎盘组织的甲基化程度发生改变,TET2(Ten-eleven Translocation)蛋白可以将5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)调节DNA的甲基化水平,TET2参与了多种疾病的发生。本文对TET2在子痫前期胎盘滋养层细胞迁移和侵袭能力方面进行了深入研究,对TET2在调控MMP9(matrix metalloproteinase 9)启动子甲基化方面进行了初步探索。本文进行如下的探究:在胎盘组织样本中,免疫组化染色法检测TET2在胎盘组织的分布。定量PCR(Polymerase Chain Reaction)检测基因TET2和MMP9转录水平的变化,蛋白免疫印迹检测基因TET2和MMP9蛋白水平的变化,焦磷酸测序检测MMP9启动子甲基化的变化。在体外细胞水平,采用人滋养层细胞系HTR8细胞通过慢病毒敲减TET2(sh-TET2)基因的表达。CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测sh-TET2细胞增殖能力;Transwell实验检测sh-TET2细胞的侵袭与迁移能力;抗血管生成因子蛋白芯片检测sh-TET2细胞细胞因子和相关蛋白的变化;定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测sh-TET2细胞MMP9的表达;BSP(Bisulphite Sequencing)测序检测sh-TET2细胞MMP9启动子的甲基化状态;酶联免疫吸附测定sh-TET2细胞MMP9的分泌;双荧光素酶报告基因检测DNA甲基化对MMP9启动子转录活性的影响;维生素C对sh-TET2细胞的功能恢复。本研究结果如下:在子痫前期的病例中发现:子痫前期患者胎盘组织的5mC水平高于正常对照组,5hmC水平低于正常对照组,TET2与MMP9的mRNA和蛋白表达水平较正常对照组降低,MMP9的启动子区-233bp位点甲基化水平较正常组升高。体外细胞实验发现:在HTR8细胞敲降TET2后,HTR8细胞的迁移与侵袭能力降低。MMP9mRNA和蛋白表达水平降低、分泌减少。MMP9启动子区甲基化水平升高。TET2可以结合在MMP9的启动子区。MMP9启动子区-233bp CpG位点的甲基化程度对启动子活性影响显著。维生素C可以部分恢复敲降TET2造成的细胞表型和MMP9的表达。综上所述,(1)TET2是将5mC氧化为5hmC的DNA去甲基化酶,在滋养层细胞HTR8中TET2通过控制MMP9启动子区的甲基化水平,调节MMP9启动子活性,控制MMP9的表达,进而影响滋养层细胞的迁移与侵袭能力。(2)维生素C可以提高TET2的酶活力,恢复因为敲减TET2导致的异常表型。因此,本文对TET2对子痫前期发病机制提供了一定的依据,为临床预防与治疗子痫前期奠定了基础。