论文部分内容阅读
背景和目的:淫羊藿是我国传统补益类药材,分布广泛,用药历史悠久,具有补肾阳,强筋骨和祛风除湿等功效,临床上常用于治疗骨质疏松、风湿病、高血压和心脏病等。中药化学成分是中药发挥药效的基础,而基原的遗传信息和环境因素会影响药材的生物合成和代谢途径,从而导致药材中的化学成分不同,进而影响临床药效。淫羊藿的主要特征成分是黄酮类化合物,具有很强的抗氧化作用,能够清除体内自由基,减少氧化应激的伤害,从而减少疾病的产生。中药质量评价与控制一直以来是中药研究的重点和难点。目前2020版药典中淫羊藿的质量评价方法是采用色谱法测定总黄酮醇苷的含量,所测定的成分单一且没有与淫羊藿药效相关联,无法全面评价淫羊藿质量,因此筛选与淫羊藿药效密切相关的潜在活性成分,对淫羊藿质量评价具有重要意义。本研究以不同基原淫羊藿为研究对象,结合UPLC-Q-TOF/MS技术,揭示不同基原淫羊藿化学成分差异,并基于谱效关系,探讨淫羊藿化学成分与抗氧化和保护氧化应激环境下的软骨细胞作用的相关性,为淫羊藿进一步开发和利用提供了药效物质基础。方法:1.不同基原淫羊藿药材化学成分组学研究:以不同基原淫羊藿为研究对象,运用UPLC-Q-TOF/MS技术对淫羊藿的化学成分进行全面分析,并采用主成分分析（principal components analysis,PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial Least Squares Discrimination Analysis,OPLS-DA）等分析方法,筛选不同基原淫羊藿药材的潜在差异化学成分,为不同基原淫羊藿药材的物质基础特异性提供科学依据。2.不同基原淫羊藿药材抗氧化作用研究:采用DPPH、ABTS和羟自由基三种检测方法评价淫羊藿药材抗氧化作用,并采用抗氧化活性综合指数（antioxidant potency composite,APC）比较不同基原淫羊藿药材的抗氧化活性。3.不同基原淫羊藿药材保护软骨细胞氧化应激损伤作用研究:利用过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）诱导C28/I2细胞构建氧化应激损伤模型,以细胞活力作为指标,评价不同基原淫羊藿对氧化应激损伤的软骨细胞的保护作用。4.淫羊藿抗氧化谱效关系模型的建立:以淫羊藿化学成分的质谱数据作为自变量,APC综合指数和软骨细胞存活率作为因变量,采用灰色关联度分析法（Grey Relational Analysis,GRA）与偏最小二乘分析法（Partial least square,PLS）进行谱效关联,建立淫羊藿化学成分与抗氧化、保护氧化应激损伤软骨细胞作用的谱效关系模型,筛选淫羊藿中与抗氧化、保护氧化应激损伤软骨细胞作用相关的活性成分。5.抗氧化关联成分药效验证:对与抗氧化、保护氧化应激损伤软骨细胞作用高度关联的化学成分进行体外实验验证研究。采用DPPH、ABTS和羟自由基三种检测方法验证其抗氧化能力,采用CCK-8法检测其对软骨细胞的保护作用,验证上述模型所筛选的结果的可靠性。结果:1.不同基原淫羊藿药材化学成分组学研究:从淫羊藿药材中发现3935个共同化学成分特征离子,其中通过数据库和文献比对共鉴定了53个化学成分。通过PCA及OPLS-DA分析证明不同基原淫羊藿化学成分存在显著差异。初步鉴定M1697、M1723、M1875、M2324、M2404、M2524、M2657、M3411、M3749、M3809、M3842、M3846、M3875、M3932为不同基原淫羊藿的潜在差异成分。本部分为不同基原淫羊藿药材的物质基础研究提供了数据支撑。2.不同基原淫羊藿药材抗氧化作用研究:不同基原淫羊藿均具有一定清除DPPH、ABTS和羟基自由基的能力,APC综合指数在38.31～80.60%范围内,说明不同基原淫羊藿抗氧化能力不同。3.不同基原淫羊藿药材保护软骨细胞氧化应激损伤作用研究:通过甲苯胺蓝染色鉴定的C28/I2细胞系为软骨细胞。CCK-8法实验确定构建C28/I2细胞氧化应激模型的H2O2浓度为1.1 m M/L,作用时间为24 h。100μg/m L的淫羊藿给药组与模型组相比,除S3、S4、S7、S10、S14、S16、S17、S18、S20、S25、S31、S36对软骨细胞无明显的保护作用外,其余24批次淫羊藿均对软骨细胞有明显的保护作用,具有统计学意义（P＜0.05）。其中S30（朝鲜淫羊藿）对软骨细胞保护作用最强,证明不同基原淫羊藿对氧化应激损伤软骨细胞的保护作用可能存在差异。4.淫羊藿抗氧化谱效关系模型的建立:综合GRA和PLS模型分析结果,预测影响不同基原淫羊藿抗氧化活性差异的主要成分可能是M3809、M1750、M3701、M3097、M1921;预测影响不同基原淫羊藿对保护氧化应激损伤软骨细胞活性差异的主要成分可能是M3809、M3844、M3846、M736、M3412、M366、M1232;其中M3809（朝藿定B）是淫羊藿中与抗氧化和保护氧化应激损伤软骨细胞药效均相关的主要活性成分。因此,选取与抗氧化、保护软骨细胞氧化应激损伤作用均相关的朝藿定B进行后续药效研究。5.抗氧化关联成分药效验证:朝藿定B具有清除DPPH、ABTS和羟自由基的能力,并存在剂量依赖性。15和20μM的朝藿定B作用于氧化应激损伤软骨细胞,均可以明显提高细胞活力（P＜0.05）,说明其对软骨细胞具有保护作用,验证了上述模型所筛选的与抗氧化、保护氧化应激损伤软骨细胞活性相关的化学成分结果具有一定的可靠性。结论:本研究利用非靶向代谢组学技术,对不同基原淫羊藿的化学成分进行全面分析和鉴定,并揭示了不同基原淫羊藿的差异性成分。同时基于谱效关系,将淫羊藿化学成分与药效相结合,探讨了与抗氧化、保护氧化应激环境下的软骨细胞活性相关的化学成分。本研究为鉴别不同基原淫羊藿提供了数据参考,同时为淫羊藿质量评价提供了方法学借鉴。