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垂体中叶素Intermedin(IMD)是新发现的内源性心血管、肾脏保护因子,属降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)超家族成员,对其在肾脏的保护机制尚不清楚。本研究采用分子生物学及细胞生物学手段,对IMD在肾脏缺血再灌注损伤(IRI)中的病理生理意义及其机制进行探讨。分为以下两个部分:一、大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型中IMD及其受体的变化目的:制备大鼠肾脏IRI模型,观察IMD及其受体系统的变化,初步探讨IMD在肾脏IRI中的作用。方法:健康雄性Wistar大鼠18只,随机分为假手术组、缺血组和IRI组。双侧夹闭肾动脉45min,再灌注12h制作IRI模型。检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)浓度,并半定量分析肾脏病理组织学变化判断模型成功与否。放射免疫分析法测定血浆、肾组织IMD及血浆肾上腺髓质素(ADM)含量。半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肾组织IMD、ADM及其受体系统CRLR、RAMP1、2、3 mRNA表达;Western blotting方法半定量分析肾组织IMD及其受体CRLR的蛋白表达。结果:⑴与假手术组相比,IRI组大鼠BUN和SCr明显升高(P<0.05);病理组织学显示IRI组大鼠肾小管上皮细胞空泡状变性、刷状缘坏死脱落等,而肾小球无明显改变,半定量评分显示该组与假手术组和缺血组之间存在统计学差异(分别为P<0.05,P<0.01),符合急性肾损伤病理改变,造模成功。⑵大鼠血浆、肾组织IMD含量,IRI组较假手术组升高53.76%、40.01%(P<0.05);较缺血组升高58.34%、42.97%(P<0.05);血浆ADM含量,IRI组较假手术组升高143.22%(P<0.01),较缺血组升高101.96%(P<0.01)。⑶与假手术组相比,IRI组肾组织IMD、ADM、CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3 mRNA相对含量分别上调了22.1%(P<0.05)、41.1%(P<0.01)、32.8%(P<0.01)、33.7%(P<0.01)、35.9%(P<0.05)、29.4%(P<0.01);IMD和CRLR蛋白表达明显增高,分别增加了80.9%,68.4%(P<0.001)。结论:肾脏IRI模型中血浆和肾组织IMD水平显著增加,同时肾组织IMD及受体系统CRLR/RAMPs的mRNA表达和肾组织IMD、CRLR的蛋白表达均出现与血浆和肾组织IMD水平变化趋势一致的增加,提示IMD参与了肾脏IRI的病理生理过程,可能在保护肾脏方面有重要意义。二、IMD对大鼠肾小管上皮细胞缺氧复氧模型的影响及机制研究目的:以肾小管上皮细胞(NRK-52E)缺氧复氧(H/R)模型模拟在体IRI,通过转染IMD真核表达质粒,探讨IMD细胞保护的分子机制。方法:⑴利用三气培养箱调整氮气压力形成缺氧条件,在缺氧1h,复氧1.5h后检测NRK-52E活细胞计数、细胞存活率和培养液上清乳酸脱氢酶(LDH)含量判断H/R模型成功与否。⑵人工合成IMD目的片段,与pMD19-T Simple载体连接形成克隆载体,再通过双酶切定向克隆技术将其亚克隆至pIRES2-EGFP,构建IMD真核表达载体,命名为pIRES2-EGFP/IMD,测序鉴定。⑶利用Fugene HD转染试剂,将pIRES2-EGFP/IMD表达质粒转染至NRK-52E细胞内,以倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,选定最优转染条件;并以RT-PCR和Western blotting方法观察其对细胞IMD mRNA和蛋白表达的影响;以G418 300μg/ml加入10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基对细胞进行筛选约2周,获得稳定表达IMD的阳性克隆NRK-52E,Western blotting鉴定筛选后IMD蛋白的表达。⑷对NRK-52E进行H/R实验,分为对照组和6个模型组包括单纯H/R组、空质粒组、IMD质粒组、IMD+PKA抑制剂(H-89)组、环磷酸腺苷(cAMP)类似物(8-Br-cAMP)组和NADPH氧化酶抑制剂(DPI)组,分别检测细胞培养液上清中LDH、cAMP含量,细胞NADPH氧化酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平,观察IMD对H/R时氧化损伤的影响及分子机制。结果:⑴经缺氧1h,复氧1.5h后,NRK-52E细胞计数量降低,存活率下降,细胞培养液上清中LDH含量显著增加(P<0.05),造模成功。⑵酶切和测序鉴定表明,pMD19-T Simple/IMD克隆质粒和pIRES2-EGFP/IMD真核表达载体构建成功。⑶荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示以质粒3μg: FuGENE HD 12μl配比的转染复合体在48h的转染效率最高,转染效率最高可达71.34±6.24%(P<0.01);半定量RT-PCR和Western blotting结果显示,转重组质粒组IMD mRNA表达量较未转染组增高(P<0.01),蛋白表达也显著增高(P<0.001)。G418筛选后转染阳性的细胞于第3天起逐渐出现克隆样增殖,第5天起未转染的细胞出现批量死亡,以后阳性细胞克隆逐渐增加,至第14天可见融合成片状的阳性克隆细胞,约占总细胞的60~70%。Western blotting结果显示,筛选后IMD蛋白的表达呈现高表达,说明细胞得到稳定表达。⑷给予各种干预因素后,各检测指标的变化如下:①LHD含量:与对照组相比,各模型组LDH显著上升(P﹤0.01);与H/R组相比,IMD质粒组与8-Br-cAMP组LDH上升幅度较小(P﹤0.05)。②cAMP含量:与对照组相比,各模型组cAMP含量明显增加,其中IMD质粒+H-89组和8-Br-cAMP组升高最为显著(P﹤0.01);与H/R组相比,IMD质粒+H-89组和8-Br-cAMP组的cAMP含量上升幅度最显著(P﹤0.01),IMD质粒组也有所上升,DPI组却有所下降(P﹤0.05)。③NADPH氧化酶含量:除DPI组外各模型组NADPH氧化酶含量均明显升高(P﹤0.01),其中8-Br-cAMP组升高幅度最小(P﹤0.05);与H/R组比较,8-Br-cAMP组和DPI组的NADPH氧化酶含量分别下降了33.92%(P﹤0.05)、52.54%(P﹤0.01)。④MDA含量:与对照组相比,模型组中H/R组(P﹤0.01)、空质粒组(P﹤0.01)、IMD质粒+ H-89组(P﹤0.05)和DPI组(P﹤0.05)的MDA含量增加;与H/R组比较,IMD质粒组、IMD质粒+ H-89组、8-Br-cAMP组和DPI组的MDA均有所下降(P﹤0.05)。⑤ROS含量:与对照组相比,模型组中H/R组、空质粒组、IMD质粒+ H-89组的ROS含量增加(P﹤0.05);与H/R组比较,IMD质粒组的ROS含量有所下降(P﹤0.05)。⑥SOD含量:模型组中IMD质粒组、IMD质粒+ H-89组和DPI组的SOD含量有所升高(P﹤0.05),其余各组与对照组和H/R组相比均无明显差别。结论:在肾小管上皮细胞H/R模型中,IMD可通过cAMP/PKA途径增加cAMP水平,抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS产生,同时上调SOD,减轻细胞氧化损伤,参与氧化与抗氧化平衡的调节,作为重要的内源性抗氧化剂实现其细胞保护作用。