论文部分内容阅读
目的构建新甾醇类药物NSC6767诱导白血病细胞HL-60向单核系分化的细胞模型,检测药物对细胞的生物学行为的影响、探讨其可能的分子机制。方法以10μmol/L NSC67657药物处理HL-60细胞5 d构建细胞分化模型,以DMSO溶剂处理HL-60细胞5 d为对照组;采用瑞氏染色、碱性α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)染色分析细胞的分化方向;采用流式细胞术分析细胞的分化程度、细胞周期分布、细胞凋亡的情况;采用乳酸脱氢酶(LD)检测试剂盒检测药物对细胞的毒性作用;采用RT-PCR和Western blot分析ICAT、β-catenin、T细胞因子4(TCF-4)的m RNA和蛋白在细胞分化前后的表达情况;采用Western blot和免疫荧光染色方法检测细胞分化前后β-catenin,TCF-4在细胞内定位情况。采用RT-PCR和Western blot分析Wnt信号通路下游靶基因c-myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、TCF-1 m RNA和蛋白在细胞分化前后的表达情况;结果瑞氏染色后观察发现:细胞在10μmol/L NSC67657作用5 d后细胞质明显增多,核仁消失,细胞核呈圆形或不规则形;α-NBE染色结果显示:对照组胞质无色,为阴性,实验组胞质中出现鲜红色的颗粒沉淀,为阳性,并能被氟化钠(Na F)抑制,抑制率>50%。流式细胞术(FCM)结果显示:10μmol/L NSC67657作用5 d后的实验组CD14+细胞数为(94.37±2.84)%,高于对照组[(1.31±0.09)%],差异有统计学意义(P<0.01);实验组G1/G0期细胞所占比例为(76.46±2.83)%,高于对照组[(59.4±5.42)%],差异有统计学意义(P<0.05);实验组S期细胞所占比例为(18.76±0.98)%,低于对照组[(34.38±2.61)%],差异有统计学意义(P<0.05);药物处理前后的HL-60细胞早期和晚期凋亡均无明显改变(均P>0.05);LD检测结果显示,LD活性也并无明显改变(P>0.05)。RT-PCR、western blot结果显示:药物作用后HL-60细胞中ICAT表达水平上调(均P<0.01);β-catenin表达水平下调(均P<0.01);细胞核中β-catenin蛋白的水平下调(P<0.01);TCF-4表达水平无明显改变(均P>0.05);细胞核中的TCF-4无明显改变(P>0.05);Wnt信号通路下游靶基因c-myc、cyclin D1、TCF-1的m RNA和蛋白表达水平均下调(均P<0.05)。免疫荧光染色结果显示:细胞核中的β-catenin蛋白减少,TCF-4无明显改变。结论NSC67657可诱导白血病细胞HL-60向单核系分化,抑制细胞增殖,但不诱导细胞凋亡,且对细胞无毒副作用;在HL-60向单核系诱导分化的过程中,ICAT表达上调,Wnt信号通路关键调节因子β-catenin及下游靶基因的表达下调。提示:ICAT可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路参与了NSC67657诱导白血病细胞HL-60向单核系分化的过程。