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MicroRNAs(miRNAs),是内源性、长约22nt的非编码单链RNA分子,广泛存在于动物、植物中,参与转录和转录后调控,主要通过与靶基因mRNAs碱基互补配对,诱导mRNAs的降解或抑制蛋白翻译而发挥沉默特定靶基因的作用。大量研究表明,植物miRNAs参与生长发育调控,以及对多种生物及非生物胁迫的响应,如病原菌侵染、干旱、温度及高盐等。目前,通过各种方法已发现大量miRNAs,但也仅仅是冰山一角。 番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的经济作物和生命科学研究的模式植物,有关番茄miRNAs的研究,尽管已取得一些进展,但大部分的miRNA有待发掘和进行功能研究。脱落酸(ABA)是植物重要的五大内源激素之一,在调节植物对环境的适应性及生物防御应答反应中发挥重要作用。目前,有关ABA应答相关miRNAs的报道鲜见。 本研究以栽培番茄为材料,叶面喷施外源ABA水溶液(7.58μmol/L),清水喷施的为对照,取叶片和对照24hr后的样品,利用RNA-Seq技术,进行了高通量小分子RNA(Small RNA,sRNA)测序及分析,研究了ABA应答的miRNAs,并分析讨论了它们的功能,获得了有价值的结果。 一、ABA应答的miRNAs全面分析 获得大于14 nt的clean reads,在对照和处理组中分别为18,179,025和17,763,348条。对照组和处理组的unique sRNAs分别为5,345,714和5,601,375条,表明ABA的处理可以诱导small sRNAs的产生;miRNA tags在对照组和处理组中分别占总RNA的10.92%和9.76%,表明外源ABA抑制miRNAs的产生。 将sRNAs比对到番茄基因组上,注释、分类,获得已知的miRNAs(known-miRNAs)365个;余下未被注释的sRNAs用于新的miRNAs(novelmiRNAs)的预测,获得novel miRNAs702个,共计1067个miRNAs。 进一步对miRNA表达量数据进行归一化,为减少噪音和干扰,去掉表达量低于2 normalized counts的miRNAs,筛选获得416个miRNAs进行下一步的差异表达分析。表达量变化|log2Ratio|≥0.25,视为表达存在差异,表明对ABA产生应答;表达量变化|log2Ratio|≥1且P<0.05,为显著差异。结果显示,共有269个miRNAs(已知的179个,新的90个)对外源ABA产生应答(,其中差异显著的有137个(已知的91个,新的46个)。下调表达的miRNAs约占三分之二,上调的约三分之一。通过靶基因预测并结合转录组测序数据分析,结果显示,miRNAs表达上调,它们的靶基因通常下调,反之亦然,表明miRNAs与靶基因的表达呈负相关。 进一步进行了与胁迫相关的miRNAs预测及分析。 二、与胁迫相关的miRNAs对外源ABA的应答 通过靶基因预测及已有研究报道,发现许多靶基因与抗逆、抗病相关。获知可能与胁迫应答相关的miRNA49个,包括37个已知的和12个新的miRNAs。分析显示,39个miRNAs受ABA影响,表达发生变化,包括23个下调表达的和16个上调的miRNAs。其中29个miRNAs表达发生显著变化,下调的16个、上调的13个,包括部分表达受到完全抑制或者诱导的miRNAs。 进一步根据靶基因和已有报道分析显示,与非生物胁迫相关的miRNAs31个(已知的26个,新的5个),与生物胁迫相关的miRNAs共26个(已知的19个,新的7个),与二者均相关的7个。ABA处理后,多数抗逆、抗病相关的miRNAs下调表达,且丰度通常较上调表达的miRNAs高,相应的抗逆、抗病靶基因上调,显示ABA正调控番茄的抗逆、抗病性,推测ABA不仅能提高番茄的抗逆能力,而且能提高其抗病能力。 综上,外源ABA能调控miRNAs的表达,引起miRNA组成及丰度变化。这种变化不仅在植物应对非生物胁迫,而且在生物胁迫的防御反应中均起着重要的作用。推测ABA调控植物对多种胁迫的适应性,可能途径之一是通过调节miRNAs和靶基因的表达及其相互作用而实现的。本研究补充了番茄miRNAs数据库,并且为进一步研究miRNA在ABA应答及环境胁迫适应中的作用提供了依据。