诊断工具酶的制备及其稳定性的研究

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近年来,由于基因工程和蛋白质工程的快速发展,使蛋白质类产品基本实现了产业化。但大多数蛋白质在溶液状态下不稳定,临床诊断工具酶一般是在液态情况下使用,所以解决蛋白质在溶液状态下的稳定性问题,是实现国产工具酶产业化的关键。最近研究发现,高半胱氨酸与100多种疾病相关,因此高半胱氨酸的检测成为基础医学和临床医学的新热点。胱硫醚β裂解酶(CBL)和胱硫醚β合成酶(CBS)是自动化分析仪检测高半胱氨酸的主要工具酶,本论文主要针对其中的CBL在溶液状态下的稳定性进行了研究。 通过克隆大肠杆菌CBL的基因,插入pET-23a(+)和pET-28a(+)载体,构建基因工程菌进行表达,分离纯化获得CBL。然后采用胰蛋白酶对文献报导的蛋白质在溶液状态中的添加剂进行预筛选,研究了九种不同添加剂在不同浓度、不同温度条件下对胰蛋白酶溶液稳定性的影响,发现其中八种添加剂在特定条件下可以不同程度的提高胰蛋白酶的稳定性,而分子量为800,2000,25000的聚乙烯亚胺(PEI)对其稳定效果较好。在此基础上,研究这三种PEI在不同浓度,不同温度的条件下对CBL溶液的稳定效果,结果表明:PEI系列可以显著提高CBL酶的稳定性,PEI800,PEI25000的稳定效果优于PEI2000。温度不同,稳定效果最好时添加剂的浓度也不同,对于PEI800和PEI2000,4℃时,稳定效果:1%>0.5%>0.1%,即浓度越大,稳定效果越好;37℃时,0.1%>0.5%>1%,即浓度越小,稳定效果越好;PEI25000只在0.1%有稳定效果。比较发现,4℃时,1%的PEI800的稳定效果相对比较好,37℃时,0.1%的PEI25000的稳定效果相对比较好。没有加入PEI稳定剂,CBL酶在一个月后酶活完全失去,而加入PEI稳定剂后,CBL酶活性在4℃和37℃分别保持了53.8%和35.3%。
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