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【研究背景和意义】血浆高分子量激肽原(High molecular weight kininogen,HK)是血浆激肽释放酶-激肽系统(Plasma kallikrein-kinin system,KKS)的关键蛋白。已有体外研究表明,HK的第三个结构域和第五个结构域的片段均具有抗菌作用。但是,对于HK在体内的作用仍然是未知的。本研究使用HK蛋白缺陷的Kng1-/-小鼠,研究HK在宿主防御细菌感染中的作用并初步探究其作用机制。【研究目的】认识HK蛋白在宿主防御细菌感染中的作用并初步探究其作用机制。【研究方法】建立大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)腹腔注射模型和盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)模型,观察Kng1-/-小鼠和其同窝对照Kng1+/+小鼠的生存率,并绘制生存曲线。通过H&E染色观察和评价盲肠结扎穿孔模型中肺脏和肝脏的病理变化;应用血平板计数检测腹腔灌洗液、血液及脾脏和肝脏组织中细菌的数目;应用实时定量PCR检测白细胞中炎症因子m RNA的表达水平;利用Western blotting方法检测HK与细菌的结合及HK的裂解;利用Kng1+/+小鼠和Kng1-/-小鼠血浆检测HK蛋白的杀菌效率;利用PK抑制剂DX-2930和FXII抑制剂CTI对血浆蛋白活性的干预,检测大肠杆菌导致HK的裂解及HK的杀菌效率是否依赖于KKS的活化。【研究结果】(1)Kng1基因敲除小鼠肝脏中没有Kng1 m RNA的表达,并且血浆中检测不到HK蛋白,证实Kng1基因敲除小鼠模型建立成功。(2)在细菌感染模型中,与Kng1+/+小鼠相比,Kng1-/-小鼠的生存率明显降低(大肠杆菌腹腔注射模型中小鼠的生存率:67.5%vs.11.111%,p=0.0017;盲肠结扎穿孔模型中小鼠的生存率:75%vs.11.667%,p=0.0434;Kng1+/+vs.Kng1-/-),提示血浆HK在宿主防御细菌感染中具有保护作用;(3)H&E染色结果显示,盲肠结扎穿孔模型中,Kng1+/+小鼠肺组织中有少量炎性细胞浸润,肺间质增生较弱,肝脏有轻微气球样变性,提示细菌感染可以导致肺脏及肝脏病理损伤。而Kng1-/-小鼠上述肺脏和肝脏病理表现明显加重,肺组织中可见大量炎性细胞浸润,肺间质增生明显,肝脏发生明显气球样变性。上述观察提示在细菌感染中,HK的缺陷可以加剧肺和肝脏组织损伤;(4)在大肠杆菌(108 colony-forming unit(CFU),200?l)腹腔注射后18小时,Kng1+/+小鼠腹腔灌洗液、血液、肝脏和脾脏中可以检测到少量细菌的存在,提示细菌感染模型成功构建。Kng1-/-小鼠上述组分中细菌的数目明显增多(腹腔灌洗液:235000±59690 vs.944400±156400 CFU,p=0.0002;血液:0.5000±0.1581 vs.3.938±1.142 CFU,p=0.0056;肝脏:90630±32260 vs.845600±156200 CFU,p<0.0001;脾脏:338100±71100 vs.1033000±154700 CFU,p=0.0003;Kng1+/+vs.Kng1-/-),提示在细菌感染中,HK的缺陷抑制体内细菌的清除。(5)应用实时定量PCR发现,在正常情况下,HK的缺陷对炎症因子的表达无影响。在大肠杆菌(108 CFU,200?l)腹腔注射6小时后,与Kng1+/+小鼠相比,Kng1-/-小鼠白细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的m RNA水平显著升高(TNF-α:17.00±5.110 vs.83.20±9.640,p=0.0001;IL-6:70.61±38.39 vs.1374±348.4,p=0.0059;Kng1+/+vs.Kng1-/-)。以上结果提示,在细菌感染模型中,HK的缺陷可以上调白细胞中炎症因子m RNA水平的表达;(6)大肠杆菌和小鼠血浆共孵育后,结合Western blotting检测发现,大肠杆菌可以与血浆中HK结合并且使HK发生裂解。当Kng1+/+和Kng1-/-小鼠血浆与细菌共孵育后,与Kng1+/+血浆相比,Kng1-/-血浆中细菌的数目有明显增加(共孵育1小时:21110±4231 vs.47000±8825 CFU,p=0.0207;共孵育2小时:4020±613.9 vs.6910±122.7 CFU,p=0.0494;Kng1+/+vs.Kng1-/-),进一步运用纯品HK与细菌共孵育,HK不被裂解,且细菌的数目与阴性对照组相比没有统计学意义,提示,只有裂解后的HK具有抗菌作用。(7)大肠杆菌分别与含有PK抑制剂(DX-2930)和FXII抑制剂(CTI)的人的血浆共孵育后,含有抑制剂的血浆中HK不裂解。与正常血浆相比,抑制血浆中PK和FXII活性后导致细菌的清除率降低(共孵育10小时:39600±5913 vs.68600±7305 CFU,p=0.0128;共孵育20小时:22400±3473 vs.36800±4236 CFU,p=0.0302;正常血浆vs.含抑制剂血浆)。以上结果提示HK的杀菌作用依赖于KKS的活化。【结论】本研究说明在宿主防御细菌感染中,血浆高分子量激肽原通过KKS的活化发生裂解释放抗菌片段,从而发挥保护作用。