研究背景： 石棉因具有保温、绝缘、耐高温等性能而广泛应用于各个领域。由于石棉已是国际公认的职业病危害因素，可诱发石棉肺和恶性肿瘤(如支气管肺癌、间皮瘤等)石棉相关疾病，发达国家已经严格限制石棉的使用，而大力提倡使用石棉替代品。耐火陶瓷纤维(Refractory Ceramic Fibers，RCF)与石棉具有相似的理化特性，是目前应用较为广泛的石棉替代品，但其对人体的危害性及其危害机理是卫生学研究的重要课题。一些体外实验可以提供耐火陶瓷纤维等石棉替代品对人体的生物危害效应及其分子作用机理等有价值的信息，其中用耐火陶瓷纤维刺激肺间皮细胞和肺上皮细胞的体外试验研究已有较多的文献报道，但人造矿物纤维对呼吸道上皮细胞，特别是支气管上皮细胞的实验研究报道较少。本项研究通过细胞毒性试验、形态学观察和分子生物学等实验方法和手段，研究耐火陶瓷纤维致体外人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cells，BEAS-2B)细胞凋亡和DNA损伤的作用，为探寻耐火陶瓷纤维诱发人体支气管肺癌的病变机理提供依据，为临床诊治提供参考。 研究目的： 研究不同理化组成和不同浓度的耐火陶瓷纤维及其浸出液对体外培养的BEAS-2B的形态变化、凋亡、DNA损伤的作用，以及相关凋亡基因caspases-3、PARP的表达水平，测试耐火陶瓷纤维及其浸出液诱导BEAS-2B产生ROS的效应，以及CAT、DMSO和甘露的抗氧化作用，初步明确RCF对人支气管上皮细胞的细胞毒性和氧化机理。 研究方法： 细胞培养：BEAS-2B细胞以RPMI1640培养液加10％胎牛血清、青霉素100U/ml、庆大霉素10mg/L、两性霉素-B2mg/L、谷氨酰胺2mM和非必需氨基酸，在37℃、5庆大霉素10mg/L、两性霉素-B2mg/L、谷氨酰胺2mM和非必需氨基酸，在37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中培养，每周传代1次，传代后第3天更换新鲜培养液。 细胞毒性试验：倒置显微镜下观察BEAS-2B细胞对台盼蓝(TrypanBlue)的吞噬，以鉴定细胞的成活率；检测细胞培养液中LDH的量，以评价耐火陶瓷纤维对细胞的毒性：噻唑蓝(MTT)法测定耐火陶瓷纤维对细胞活力的影响。 细胞形态观察：HE染色观察细胞形态变化，扫描电镜观察细胞吞噬纤维行为。 单细胞凝胶电泳：检测耐火陶瓷纤维及其浸出液对细胞DNA的损伤程度及细胞自身DNA修复能力。 DNALADDER试验：用琼脂糖凝胶电泳分离DNA技术检测耐火陶瓷纤维及其浸出液致BEAS-2B细胞凋亡作用。 YO-PRO-1和PI联合染色定量检测细胞凋亡：用YO-PRO-1和PI联合染色定量检测耐火陶瓷纤维及其浸出液致细胞发生凋亡的比例。 RT-PCR检测mRNA水平：用耐火陶瓷纤维悬液及浸出液刺激BEAS-2B细胞后，提取总RNA并逆转录成cDNA，RT-PCR法检测细胞中caspases-3、caspases9和PARP1的表达水平。 细胞内ROS的测定：以耐火陶瓷纤维刺激BEAS-2B细胞，用荧光探针2，7-二氯荧光素二脂(DCFH-DA)和双氢罗丹明123(DHR123)测定细胞内ROS水平，并用CAT、DMSO和甘露醇观察它们对ROS产生的抑制作用。 结果： BEAS-2B细胞成活率及青石棉毒性：细胞吞噬台盼蓝(TrypanBlue)实验显示，20μg/cm2浓度的耐火陶瓷纤维作刺激细胞24h后，95％的细胞拒染；400μg/ml耐火陶瓷纤维浸出液刺激细胞24h后，大于93％的细胞拒染；MTT实验表明，100μg/cm2以上浓度的耐火陶瓷纤维刺激BEAS-2B细胞24h后，细胞活力明显下降。 细胞形态：HE染色可见凋亡细胞，纤维粘附在细胞上；电镜下可见20μg/cm2耐火陶瓷纤维刺激24h后，细胞微绒毛消失，表面光滑，细胞有吞噬纤维行为。 BEAS-2B细胞的DNA损伤及DNA修复：经三种20μg/cm2耐火陶瓷纤维悬液及400μg/ml浸出液刺激后，细胞产生DNA拖尾现象，与阴性对照组比较均有显著性差异(P＜0.05，n=3)，有时间-效应关系。移去刺激物后，细胞的DNA损伤得到不同程度的修复。抗氧化剂可以减少DNA损伤。 细胞凋亡：20μg/cm2耐火陶瓷纤维悬液及400μg/ml浸出液刺激48h后，细胞产72h后小于22％。 Caspases-3、PARP1和caspases9的mRNA水平：20μg/cm2耐火陶瓷纤维悬液及400μg/ml浸出液刺激24h及48h后细胞中caspases-3、caspases9的mRNA水平高于空白组，PARP1的mRNA水平低于对照组。 细胞内ROS的产生量：荧光探针DHR123与DCFH-DA检测细胞内ROS水平，用CAT、DMSO和甘露醇预处理BEAS-2B细胞后，耐火陶瓷纤维及悬液刺激细胞产生的ROS量减少。所以，耐火陶瓷纤维诱导产生的ROS以H2O2和-OH为主。 结论： 1.耐火陶瓷纤维及浸出液致BEAS-2B细胞DNA损伤，且有时间-效应关系。 2.去除耐火陶瓷纤维及浸出液刺激后，DNA损伤得以修复，抗氧化剂可减少DNA损伤。 3.耐火陶瓷纤维及浸出液致BEAS-2B细胞凋亡，凋亡相关基因caspase-3、caspase-9的mRNA水平随刺激时间增加而增加，PARP1的mRNA水平随刺激时间而轻度下降，抗氧化剂可以抑制caspase-3，caspase-9的表达，增加PARP1的表达。 4.耐火陶瓷纤维悬液及浸出液诱导BEAS-2B细胞产生ROS，产生的ROS以羟自由基(-OH)和过氧化氢(H2O2)为主；抗氧化剂可以抑制耐火陶瓷纤维诱导细胞产生ROS。