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目的:肺腺癌是肺癌最常见的形式之一,肺癌的免疫疗法已成为一种有前景的治疗方式。基于免疫检查点抑制剂（ICIs）开发的单克隆抗体药物,如PD-1和CTLA-4抑制剂响应率低和毒性大的缺陷,我们尝试使用与PD-L1表达互斥的Siglec15作为靶点,制备单克隆抗体,探讨其对肺腺癌的治疗作用,验证靶点有效性。在此基础上制备可自分泌Sigelc15sc Fv的c Met CAR-T细胞,并探讨其对肺腺癌的杀伤作用,进一步研究其对肺腺癌的作用机制和对肿瘤微环境的调控作用,为肿瘤免疫治疗和新药研发提供科学依据。方法:1.采用生物信息学分析方法,通过NCBI和IMGT人源抗体数据库检索出Siglec15基因和蛋白序列信息以及结构信息,通过CCLE数据库检索出该基因在肿瘤细胞中的表达概况,利用Swiss Targer Prediction database获得与该靶点相关的蛋白信息,通过String、Uniport、intomics数据库获得蛋白互作信息与评分,最后通过GO富集分析和KEGG数据库查阅该靶点相关通路,为后续机制研究提供方向。2.在前期基础上设计抗Sigelc15抗体序列,定制重组人Siglec15全基因蛋白;免疫Balb/c小鼠,经过筛选定株和抗体亚型检测,制备稳定分泌该抗体的杂交瘤细胞,提取该细胞的RNA并进行逆转录,扩增抗体可变区基因;使用Infusion PCR技术重组表达质粒并进行转化,挑克隆,经测序验证序列与设计一致后,利用293F细胞对该抗体进行真核表达,将Siglec15 VH和VL质粒共转染到293F细胞中,收上清进行蛋白纯化;完成对纯化后的抗体的功能鉴定;CCK8法检测抗Siglec15 Ig G对肿瘤细胞增殖抑制作用;Transwell实验和划痕实验检测该抗体对肿瘤细胞的侵袭和迁移能力的影响;利用PMA诱导分化Thp-1细胞,检测该抗体对诱导的巨噬细胞的分化、增殖抑制和迁移的影响;建立裸鼠肺腺癌原位癌模型,评价抗Siglec15 Ig G对裸鼠肺腺癌的治疗作用和靶点有效性。3.利用overlap PCR方法设计并构建c Met/Siglec15 CAR质粒;采用Infusion PCR法对c Met/Siglec15 CAR进行慢病毒载体构建;利用感受态技术将慢病毒质粒进行转化和挑克隆,经测序验证慢病毒载体有效性;将c Met/Siglec15CAR慢病毒表达载体瞬时转染293T细胞,制备慢病毒并进行病毒滴度测定;分离人外周血PBMC后,对T细胞进行活化培养,用制备好的CAR慢病毒感染T细胞,FCM检测c Met/Siglec15 CAR-T细胞分型及转染效率。4.利用LDH释放实验检测c Met/Siglec15 CAR-T细胞对不同肺腺癌Siglec15阳性细胞的不同效靶比或固定效靶比时的杀伤作用;ELISA检测c Met/Siglec15 CAR-T杀伤过程中IL-2和IFN-γ细胞因子分泌;制备鼠源c Met/Siglec15 CAR-T细胞,观察其对鼠肺腺癌原位癌模型治疗作用,检测小鼠的体重、瘤重、血生化、活体成像、脏器指数变化;采用免疫组化HE检测瘤体病理改变、IHC检测巨噬细胞相关标志物表达、T细胞浸润情况;采用RT-q PCR、Western-blot检测肺腺癌肿瘤组织通路相关Siglec15、DAP12、MUC-1、SYK、NF-κB等基因和蛋白表达变化,巨噬细胞亚型相关基因和蛋白表达。结果:1、利用生物信息学方法可知Siglec15表达在髓系和免疫细胞表面,在正常组织中表达量低,在肿瘤细胞中表达量较高;与其相关的蛋白有10个,互作途径23条,主要与细胞粘附、免疫调节和破骨细胞发育有关。Siglec15为跨膜蛋白,其结构由免疫球蛋白（Ig）样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。免疫球蛋白样结构域由2个胞外Ig域组成,包括一个包含唾液酸结合位点的N端V-set域和2型恒定区（Ig C2）区组成,与TYROBP（DAP12）互作最为密切。2.成功进行抗Siglec15抗体的纯化,亚型鉴定为Ig G1型。抗体经变性SDS-PAGE检测显示,抗体重轻链大小与预期一致,重链55k Da左右,轻链35k Da左右,抗体纯度在95%以上。该抗体可以在14个浓度与相应的抗原发生特异性结合,且在浓度较低时仍然可以与抗原发生特异性结合,说明该抗体的特异性结合能力达到后续实验的要求。Siglec15阳性表达的A375、U87MG、Raji、THP-1、HCT-8细胞均可与纯化得到的抗Siglec15抗体发生特异性结合,而阴性表达细胞HFL-1没有产生明显条带。KD值均为5.719e（-8）。在多肽稀释倍数为1:100时A9的OD值最高,说明该表位与抗Siglec15全分子Ig G特异性结合能力最强,并且可与糖基化s Tn蛋白产生竞争性结合,与文献描述一致。另外与表位鉴定时筛选出的三个OD值较高的位点进行竞争性ELISA实验,证实其对A9、B8、B9三个表位具有良好的竞争性结合能力,与A9的竞争性结合能力优于其余两个位点。3.由抗体量效曲线确定剂量后进行肿瘤细胞生物学功能检测,抗Siglec15抗体能够抑制肺腺癌A549、H1299、H460、PC-9细胞的增殖能力,但对人肺上皮HBE细胞的增殖能力无显著影响。该抗体对Siglec15敲减后的细胞增殖和迁移能力的影响减弱,对人肺腺癌A549细胞、H1299细胞、鼠肺腺癌LLC细胞的侵袭具有显著抑制作用,但对人大细胞肺癌H460和正常肺上皮细胞HBE的侵袭能力无显著影响。能够对PMA诱导分化的巨噬细胞形态产生明显影响。加入抗Siglec15抗体增加M1型巨噬细胞的贴壁,抑制M2型巨噬细胞生长和贴壁。细胞增殖率由高到低依次为:抗体+M1组＞M1组＞M2组＞抗体+M2组≈M0细胞组。经诱导分化后的M0细胞加入该抗体后,M1型巨噬细胞相关蛋白表达显著升高（P＜0.01）,M2型巨噬细胞相关蛋白表达显著下调（P＜0.01）。4.抗体治疗作用:建模后裸鼠体重先升高,再降低。给药后高剂量组裸鼠与空白对照组裸鼠体重有所上升,但低剂量组体重低于模型组。第二次给药后,给药组和模型组裸鼠都伴有不同程度的死亡。模型组小鼠瘤重与低剂量组相近,中剂量和高剂量组瘤重显著轻于模型组（P＜0.01）。各组间瘤重变化明显。5.将重组质粒转化至E.coli Top10细胞,挑阳性克隆后,提取质粒,进行双酶切验证及测序,两者结果显示均与理论序列一致;Western blot法检测到CAR质粒均有CD3ζ的表达;对IP产物进行蛋白电泳,Western blot发现转染了c Met/Siglec15 CAR的细胞上清中在35KDa左右出现了特异性条带,与理论值接近,切胶进行质谱分析后发现相似比较高;Western blot法检测到c Met/Siglec15 CAR的泳道中HA tag标签的存在,说明本实验所构建的c Met/Siglec15 CAR质粒可以在体外分泌出抗Siglec15sc Fv;慢病毒滴度为7×10~8PFU/m L,采用FCM检测c Met/Siglec15 CAR-T细胞的CD8+比例约为66.7%,CD4+比例约为25.3%,c Met/Siglec15 CAR、c Met CAR以及CD19 CAR慢病毒的转染效率分别为45.8%、47.2%、49.6%。6.LDH释放实验检测c Met/Siglec15 CAR-T细胞在不同效靶比和固定效靶比均能够对肺腺癌细胞起到一定的杀伤作用,且杀伤效果由强到弱为:c Met/Siglec15 CAR-T＞c Met CAR-T＞CD19 CAR-T≈Activated T细胞（P＜0.01）,随着加入靶细胞的量的下降,杀伤作用下降,其中对A549细胞和LLC杀伤作用最为显著（P＜0.01）,对Siglec15以及c Met进行敲减后,可显著影响效应细胞对靶细胞的杀伤作用（P＜0.05）;c Met/Siglec15 CAR-T细胞分泌的IFN-γ和IL-2水平均高于c Met CAR-T细胞（P＞0.05）和其他T细胞组（P＜0.01）;对于正常肺上皮HBE细胞,c Met/Siglec15 CAR-T细胞分泌的IFN-γ和IL-2水平与其他各组细胞没有明显差异（P＞0.05）。Unrelated CAR-T细胞组即CD19 CAR-T和活化的T细胞组对肿瘤细胞的杀伤作用及细胞因子分泌的影响均差异无统计学差异（P＞0.05）。7.动物实验结果,小鼠体重:c Met/Siglec15 CAR-T组＞c Met CAR-T+抗Siglec15抗体组＞c Met CAR-T组＞CD19 CAR-T组＞Activated T组,治疗后小鼠脾脏和胸腺指数有所上升,但差异不显著（P＞0.05）,提示细胞治疗可能对小鼠脾脏和胸腺功能无明显影响;小鼠肿瘤体积:c Met/Siglec15 CAR-T组＜c Met CAR-T+Siglec15 Ig G组＜c Met CAR-T组＜CD19 CAR-T组＜Activated T组（P＜0.01）;小鼠血清生化检测结果显示,与对照Activated T组相比,其余各组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮均有显著降低（P＜0.01）,仅c Met/Siglec15 CAR-T组和c Met CAR-T+Siglec15 Ig G组可使血清肌酐水平显著降低（P＜0.05）;HE病理切片显示,c Met/Siglec15 CAR-T组肺腺癌细胞数量减少,局灶坏死,间质纤维化,淋巴细胞、组织细胞、多核巨细胞浸润,与其余几组相比,具有良好的抑瘤效果;IHC检测结果显示,c Met/Siglec15CAR-T细胞组和c Met CAR-T+Siglec15 Ig G细胞组中T细胞浸润显著多（P＜0.01）;肿瘤组织M2型巨噬细胞标志物IHC结果显示:c Met/Siglec15 CAR-T细胞和c Met CAR-T+Siglec15 Ig G细胞组的M2标志物明显减少,其余几组无明显变化。RT-q PCR结果显示:c Met/Siglec15 CAR-T细胞组可显著下调DAP12、SYK、NF-κB、MUC-1、s Tn蛋白表达以及下调M2样细胞因子,并且上调M1样细胞因子表达（P＜0.01）。结论:1.抗Siglec15抗体对肺腺癌具有一定治疗作用,能够杀伤肿瘤细胞,可能通过干预巨噬细胞极化,影响肺腺癌肿瘤微环境发挥作用。2.c Met/Siglec15 CAR-T细胞结构完整,各部分表达正确,可自分泌出Siglec15sc Fv。3.c Met/Siglec15 CAR-T细胞能够在体内外对肺腺癌细胞具有显著杀伤作用。4.c Met/Siglec15 CAR-T细胞可显著抑制肺腺癌原位癌细胞生长,增加肿瘤微环境T细胞浸润、下调M2型巨噬细胞,靶向Siglec15,下调MUC-1和s Tn表达,可以通过DAP12/SYK/NF-κB通路,抑制肺腺癌发展。