【摘 要】
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是世界上造成食源性疾病危害性最大的致病菌之一,因为它经常存在于冷冻和冷藏食品中,例如肉类、水产品和冰淇淋等。金黄色葡萄球菌是低温食品中最容易检出的食源性致病菌之一,易对人体造成严重的健康问题和恶劣的经济损失。本试验以从低温食品分离的野生型金黄色葡萄球菌为研究对象,对金黄色葡萄球菌的低温耐受能力进行区分,并发现一株能形成小菌落变种（Smal
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目编号:31601572）； 河南省自然科学基金面上项目（项目编号:222300420455）； 河南省高校科技创新人才支持计划（项目编号:22HASTIT034）； 郑州市重大科技专项（项目编号:2020CXZX0084）； 河南省留学人员科
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是世界上造成食源性疾病危害性最大的致病菌之一,因为它经常存在于冷冻和冷藏食品中,例如肉类、水产品和冰淇淋等。金黄色葡萄球菌是低温食品中最容易检出的食源性致病菌之一,易对人体造成严重的健康问题和恶劣的经济损失。本试验以从低温食品分离的野生型金黄色葡萄球菌为研究对象,对金黄色葡萄球菌的低温耐受能力进行区分,并发现一株能形成小菌落变种（Small Colony Variants,SCVs）的菌株。并通过分光光度计、流式细胞仪、透射电镜和激光共聚焦方法探究低温对金黄色葡萄球菌细胞膜的损坏情况。随后使用转录组测序技术（RNA-seq）分析金黄色葡萄球菌低温下转录表达能力差异机制,为低温食品中金黄色葡萄球菌的安全控制提供理论依据。主要研究结果如下:（1）对从低温食品中分离出的178株金黄色葡萄球菌进行7 d的低温处理,评估其低温耐受能力的差异。结果发现38株低温敏感型和26株低温耐受型,并且发现一株能形成小菌落变种的BB-1菌株。其在7 d低温胁迫后数目仅下降1.00 log CFU/m L,存活率为89.9%。随后对3株低温耐受能力差异显著的金黄色葡萄球菌（BK-1、BH-25和FA-3）和BB-1进行胞内容物泄露量和菌悬液电导率测定及结晶紫染色分析,结果发现BB-1细胞膜的完整性在低温胁迫下均强于其余3株。最后通过实时荧光定量PCR分析4株金黄色葡萄球菌抗性调节的主要基因（rsb V、rsb W和sig B）和细胞膜脂肪酸合成的主要基因（fab D、fab F、fab G、fab H和fab I）表达量的变化,发现BB-1菌株的抗性调节基因和细胞膜脂肪酸合成基因表达水平显著高于其余3株（p＜0.05）,可能在分子层面上诠释了BB-1菌株在低温下可形成SCVs细胞的原因,并通过对基因表达的调节维持细胞膜的完整性,增强低温耐受能力。（2）基于（1）部分的研究结果,选择出2株低温耐受能力不同的金黄色葡萄球菌（BB-11和BA-26）进行后续实验。使用流式细胞仪和激光共聚焦在宏观上检测金黄色葡萄球菌细胞膜破损情况,结果发现BB-11的细胞膜完整性显著优于BA-26（p＜0.05）。通过透射电镜直观的观察金黄色葡萄球菌细胞结构的变化,发现BB-11细胞膜破损程度较小而BA-26细胞膜皱缩程度较大且数目较多。最后使用微孔板分光光度计比色法测定低温处理中金黄色葡萄球菌微量丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量,以评估金黄色葡萄球菌在低温下氧化应激能力的差异,发现低温处理下BB-11的氧化应激能力显著高于BA-26（p＜0.05）。由于氧化应激能力的差异可能使得金黄色葡萄球菌体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的清除状况不同,使得细胞膜遭到不同程度的破坏,揭示了BB-11的细胞膜完整性低温维持能力优于BA-26的原因。（3）通过转录组测序技术（RNA-seq）分析两株低温耐受能力不同的金黄色葡萄球菌在低温下的基因表达差异,结果发现BB-11低温下共有833个基因显著性差异表达,其中有424个基因上调,409个基因下调;BA-26共有527个基因显著性差异表达,其中有292个基因上调,235个基因下调。随后,使用实时荧光定量PCR技术对RNA-seq测得的差异显著基因进行验证,发现BB-11组拟合相关性R~2为0.79582,BA-26组拟合相关性R~2为0.85071,说明这两种测定的结果具有良好的一致性。RNA-seq的进一步生物信息学分析结果显示,由于细胞膜受损,与BA-26相比,BB-11中细胞膜脂肪酸生物合成（fab G）的表达显著上调。过氧化氢酶（kat A）、还原型谷胱甘肽（grx C）和过氧化物酶（ahp C）在BB-11中显著上调,导致氧化应激反应能力增加,但BA-26相关基因下调。NADH脱氢酶（nad E）和α-葡萄糖苷酶（mal A）在低温耐受型菌株BB-11中上调,但在低温敏感型菌株BA-26中下调,表明能量代谢可能在低温胁迫下的金黄色葡萄球菌中起作用。此外,asp23、gre A和yaf Y参与的防御机制在BB-11的低温应答反应中发挥了重要作用。总之,通过对178株金黄色葡萄球菌筛选后,我们发现不同的金黄色葡萄球菌的低温耐受能力有显著的差异。BB-1菌株在抗性调节基因和细胞膜脂肪酸合成基因表达水平都较高,这可能诠释其在低温下可形成SCVs细胞以及存活能力更强并且细胞膜更完整的原因。而对其余两株金黄色葡萄球菌（BB-11和BA-26）进行后续研究后,发现两株菌的细胞膜完整性和胞内的氧化应激能力有较大的差异。通过转录组学测序后,我们发现细胞膜脂肪酸合成、氧化应激反应、能量代谢和调节系统相关基因的表达水平差异,是金黄色葡萄球菌低温抗性差异的重要机制。
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