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宠物肿瘤已成为临床常见病,给宠物带来了极大的痛苦。其中,乳腺癌因具有较强的增殖性与转移性,成为恶性肿瘤之一。在临床中,乳腺癌发病率达总病例的50%。乳腺癌治疗主要依赖于手术、化学治疗及放射疗法,但在动物诊疗过程中需进行全身麻醉,成本十分昂贵。此外,在化疗过程中副作用较大,易出现耐药性。目前,光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）因具有较高的疗效、副作用小以及无创等特点而受到广泛关注。PDT通过光照射光敏剂（Photosensitizer,PS）,将瘤内氧气转化为活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）杀灭癌细胞。然而,在PDT治疗过程中氧气被大量消耗,造成严重的缺氧环境并进一步诱导低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1,HIF-1α）表达量升高,从而阻碍PDT的治疗效果,并进一步诱发肿瘤转移。利非西呱（YC-1,[3-（5-羟甲基-2-呋喃基）-1-苯甲基吲唑]）是一种HIF-1α抑制剂,它既能阻断HIF-1α转录,又具有抗血管、抗癌等多种生物活性。然而,微弱的溶解性及缺乏对肿瘤细胞的靶向性等缺点,严重阻碍了YC-1的体内应用。近年来,纳米药物由于在提高药物溶解性、生物利用度以及降低毒副作用等优势而被广泛应用。为了最大限度地提高抗肿瘤疗效,研究人员探索了具有刺激响应性的纳米粒（Nanoparticles,NPs）,通过内源性或外源性的刺激反应（如p H、ROS、氧化还原和缺氧）,实现高效抗肿瘤的目的。因此,本文基于PDT恶化的瘤内缺氧环境和肿瘤细胞CD44受体靶向透明质酸（Hyaluronic acid,HA）的基础上,设计了一种具有靶向功能的缺氧敏感的纳米载体（HC/PI@YC-1 NPs）,该载体共同包封Ce6（光敏剂）和YC-1（HIF-1α抑制剂）。在尾静脉给药后,HC/PI@YC-1 NPs通过透明质酸介导的主动靶向作用在肿瘤部位富集。在光照下,产生大量的ROS在消除肿瘤细胞的同时,造成的局部缺氧环境促进纳米粒解离、释放YC-1,实现肿瘤杀伤与抑制HIF-1α表达,并进一步增强光动力的治疗效果并预防肿瘤转移。本试验在克服光动力治疗弊端的同时,为动物肿瘤治疗提供一种新型、高效的治疗策略。具体研究内容如下所示:1.试验一制备具有缺氧敏感的纳米粒,并对纳米粒进行表征。首先,合成的烷基化2-硝基咪唑（2-nitroimidazole,NI）共轭聚乙烯亚胺（PEI）和光敏剂（Ce6）修饰的透明质酸（HA-Ce6）,其能够自组装形成纳米粒并封装YC-1（HC/PI@YC-1 NPs）。试验表明,在体外光照（660 nm,5 m W/cm~2）下,产生高水平的活性氧自由基消除肿瘤,并造成严重的缺氧环境能够引起疏水性的2-硝基咪唑转化为亲水性的2-氨基咪唑（2-aminoimidazole,AI）,触发NPs的解离。DLS检测HC/PI@YC-1 NPs在正常环境中的粒径为180 nm;而在缺氧环境中,HC/PI@YC-1 NPs的粒径急剧增加至800 nm。与此同时,检测光照前后YC-1释放情况,与正常环境相比,在缺氧环境中48 h内YC-1释放率为70%。此外,HC/PI@YC-1 NPs在血清中共孵育3 d粒径的增长缓慢,表明NPs具有良好的血清稳定性。2.试验二评估纳米粒在小鼠乳腺癌细胞中的靶向性以及协同抗肿瘤疗效。由于透明质酸能够与肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体相结合,因此,将透明质酸结合到纳米粒表面能够有效提高内吞量。试验证明,相比于L929细胞（小鼠成纤维细胞）,4T1细胞对纳米粒摄取量显著增加。随着HC/PI@YC-1 NPs内吞进入细胞,在光照下（660 nm,5 m W/cm~2）,产生大量的ROS诱导细胞死亡,同时造成的缺氧环境能够进一步促进YC-1释放,从而实现光动力治疗和光动力激活的YC-1之间的协同抗肿瘤疗效。结果表明HC/PI@YC-1 NPs中YC-1（7.6μg/m L）和Ce6（1.4μg/m L）的半数抑制浓度(IC50)都低于其它单一治疗组,且两药协同效率（CI值）小于1。表明HC/PI@YC-1 NPs能够实现协同抗肿瘤治疗。3.试验三在小鼠乳腺癌模型上评估HC/PI@YC-1 NPs在尾静脉给药后的体内协同抗肿瘤疗效。在18 d的治疗期间,HA/PI@YC-1 NPs（单一药物治疗组）和HC/PI NPs（单一PDT治疗组）仅表现出部分的抑制肿瘤生长效果,而HC/PI@YC-1 NPs产生显著抑制肿瘤生长效果,并且在52 d表现出较高的存活率。此外,小鼠体重以及小鼠组织病理切片均无明显变化,证明HC/PI@YC-1 NPs具有较高的组织安全性。4.试验四在小鼠转移性乳腺癌模型上评估HC/PI@YC-1 NPs的预防肿瘤转移效果。5周内对小鼠进行小动物活体生物荧光成像,试验结果表明,PBS组与单一PDT组在第4周开始出现肺部转移。并且单一PDT组在第5周肺部生物发光信号最强,表明仅使用光动力治疗可能引起严重肺部转移的现象。而HC/PI@YC-1 NPs在第五周的小鼠全身的生物发光信号均显著降低。而且HC/PI@YC-1 NPs肺部病理切片和肺部肿瘤结节数据均表明肿瘤病变面积显著减少。证明HC/PI@YC-1 NPs具有显著的预防肿瘤转移疗效。综上所述,本文成功构建一种共载YC-1和Ce6的缺氧敏感的纳米粒（HC/PI@YC-1NPs）,在光照下产生大量活性氧自由基诱导细胞死亡。此外,造成缺氧环境可以促进载体解离、特异性释放YC-1,从而实现光动力治疗与YC-1的协同抗肿瘤及预防肿瘤转移的目的。本研究为动物肿瘤治疗提供了新的试验基础和思路。