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目的:
本课题研究采用体内与体外模型结合，以中药复方脂肝合剂干预高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFLD模型，以及复方冻干粉、含药血清干预游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂肪变性的NAFLD细胞模型进行研究，明确复方脂肝合剂对非酒精性脂肪性肝病肝细胞脂质沉积的治疗作用及其相关机制。
方法:
实验一:脂肝合剂改善高脂饲养诱导NAFLD模型小鼠肝脏脂质沉积作用机制研究
1.脂肝合剂水煎剂制备
中药复方脂肝合剂由山楂、郁金、黄芪、柴胡、丹参、决明子等组成，将上述中药按照比例称取，加入10倍量水煎煮提取2次，每次1.5小时，合并两次提取液，过滤，将其浓缩成59/ml生药的药液，50ml离心管分装，-20℃保存备用。
2.雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组、普罗布考阳性药对照组，每组10只，除正常组外，其余各组均给予含60％kcal的高脂饲料喂养12周，建立NAFLD模型，分别以低剂量(1.25g/ml)、高剂量(5g/m1)脂肝合剂或普罗布考(500mg/kg)灌胃，2次/日，连续给药8周，正常组给予生理盐水灌胃作空白对照，干预结束后，各组小鼠称重后取材，摘取脂肪、全肝组织，称重，分装，-80℃保存。
3.指标检测
1)自药物干预起，每两周记录动物体重。
2)药物干预结束后，记录各组小鼠体重、取材并记录全肝重量，计算肝指数。
3)血清试剂盒检测各组小鼠血脂四项、游离脂肪酸水平和肝功能水平。
4)酶联免疫吸附(ELISA)检测各组小鼠血清瘦素(Leptin)表达情况
5)H&E染色观察各组小鼠肝组织、白色脂肪组织病理情况。
实验二:脂肝合剂冻干粉改善游离脂肪酸诱导HepG2细胞脂质沉积作用机制研究
1.脂肝合剂冻干粉制备:将预先准备的脂肝合剂水煎剂放于一次性无菌培养皿内，放入冷冻真空干燥机内，干燥至少24小时，将真空干燥后的脂肝合剂水提物冻干粉迅速收集并低温保存。
2.细胞培养
HepG2细胞按每孔3×105个的密度接种于6孔板内，每孔加入2ml含10％FBS+1％青链霉素的DMEM高糖完全培养基，实验为5组:正常对照组、FFA模型组、FFA+脂肝合剂组、FFA+AMPK激活剂组、FFA+AMPK抑制剂组，细胞贴壁24小时后，去原培养基，除正常组外，各组加入以DMEM高糖培养基稀释终浓度为lmM的FFA造模液和对应药物的混合物共培养24小时。继续进行后续实验。
实验三:脂肝合剂含药血清改善游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂质沉积作用机制研究
1.脂肝合剂含药血清制备:10周龄雄性SD大鼠20只，体重约330-3609)，随机分为正常组及给药组，分别给予中药复方脂肝合剂和生理盐水灌胃，每次按1ml/100g大鼠体重分别进行灌胃，2次/日，连续1周。各组大鼠最后1次灌胃2小时后，2％戊巴比妥麻醉，腹主动脉采血，3500rpm，15分钟，离心分离含药血清和对照血清。将每组10只大鼠血清分别混合，56℃水浴30分钟灭活，0.22μm过滤后分装置-80℃冰箱保存备用。
2.细胞培养:HepG2细胞按每孔3×105个的密度接种于6孔板内，每孔加入2ml含10％FBS+1％青链霉素的DMEM高糖完全培养基，实验为6组:正常大鼠血清对照组、FFA组、FFA+5％MS组、FFA+10％MS组、FFA+15％MS组、FFA+20％MS组，细胞贴壁24小时后，去原培养基，加入用DMEM高糖培养基稀释终浓度为lmM的FFA造模液培养24小时，去造模液，加入含有不同浓度含药血清和2％青链霉素配制的DMEM完全培养基培养24h。继续进行后续实验。
结果:
实验一
一、脂肝合剂虽未能明显减轻NAFLD小鼠体重但能改善肝指数
1.体重与肝指数
①与正常组比较，模型组体重明显增加，差异具有显著性P＜0.01。药物干预前，HFD模型组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组、普罗布考阳性对照组各组间小鼠体重差异不具有统计学意义。
②肝指数
正常组小鼠肝指数最低，HFD模型组小鼠肝指数最高，两组间比较差异具有统计学意义。组间比较显示，普罗布考组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组与HFD模型组比较，差异均具有显著性(P＜0.01)。
二、脂肝合剂改善NAFLD小鼠脂肪组织病理及瘦素水平
1.酶联免疫吸附(ELISA)检测血清瘦素(Leptin)结果提示:与正常组比较，HFD模型组血清瘦素水平明显升高，差异具有显著性(P＜0.01)，与模型组比较，仅复方高剂量组瘦素水平下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.H&E染色观察各组小鼠白色脂肪组织病理情况
正常组小鼠白色脂肪组织细胞排列紧密，体积匀称，大小均匀，HFD模型组白色脂肪细胞体积明显增大，呈椭圆或圆形，排列疏松，脂肝合剂各剂量组白色脂肪细胞较HFD模型组均有明显改善，脂肪细胞体积明显缩小且排列较紧密。普罗布考组虽有改善，但不如脂肝合剂高剂量组明显。
三、脂肝合剂改善NAFLD小鼠肝脏脂质沉积
1.血清脂质水平
与正常组比较，模型组血脂水平明显增高，差异具有显著性(P＜0.01);与模型组比较，各干预组血清TC、TG、LDL-C、NEFA均有不同程度的下降，差异具有显著性(F=46.6，P=0.000;F=7.617，P=0.000;F=22.486，P=0.000;F=13.891，P=0.000)。
2.H&E染色观察肝脏病理情况
高脂饮食诱导NAFLD组小鼠肝脏肝细胞体积增大，部分肝细胞呈气球样变，胞内可见明显空泡，细胞核被胞内脂质挤至偏向细胞膜。普罗布考阳性药对照组小鼠肝细胞排列较模型组紧密，肝细胞形态未见明显异常，胞内散在脂质沉积，低剂量组小鼠肝内仍可见部分肝细胞呈空泡状，胞内脂质沉积明显，高剂量组小鼠肝细胞排列较紧密，胞核居中，细胞未见明显脂质沉积及肝细胞气球样改变，仅可见肝细胞间留有少许空隙。
四、脂肝合剂改善NAFLD小鼠血清肝功能损害
高脂喂养12周，NAFLD模型小鼠血清肝功能表现为ALT表达持续升高且高于AST为主要表现。经脂肝合剂口服给药干预后，各干预组小鼠血清肝功能水平均有不同程度的下降，其中以脂肝合剂高剂量组最为明显。
实验二
一、FFA诱导HepG2细胞脂肪变性细胞模型浓度筛选。
当FFA浓度处于2mM，细胞活力明显抑制，提示该浓度下的FFA具有细胞毒性，故本次实验选择FFA浓度为1mM，用于后续实验。
二、脂肝合剂冻干粉药物干预浓度筛选
MTT结果显示:当ZGLP浓度超过1000μg时，存在明显细胞毒性，细胞存活率下降明显(P＜0.05)。为了降低ZGLP对肝细胞的毒性作用，我们选取1000μg作为ZGLP的最佳药物干预浓度，用于后续实验。
三、AMPK激活剂、抑制剂药物干预浓度筛选
MTT结果显示:与对照组比较，当AICAR浓度超过2mM时;Doxorubicin hydrochloride浓度超过2μM，开始存在明显细胞毒性，细胞存活率下降明显(P＜0.05)。因此，我们选取AICAR(1mM)、Doxorubicin hydrochloride(1μM)作为最佳药物干预浓度，用于后续实验。
四、脂肝合剂和抑制及激活KMPK表达对HepG2细胞脂质沉积的影响
1.GPO-PAP法检测HepG2细胞内TG含量
与对照组比较，FFA组与AMPK抑制剂(DOX)组HepG2细胞内TG含量明显增加(P＜0.01));与FFA组比较，AMPK激活剂(AICAR)组和脂肝合剂冻干粉组HepG2细胞内的TG含量明显减少。
2.油红0染色
正常组HepG2细胞内未见脂滴，FFA组经FFAlmM处理24小时后，脂滴含量明显增多;AMPK抑制剂(DOX)组HepG2细胞内脂滴明显，部分有脂滴融合现象;与FFA组比较，AMPK激活剂(AICAR)组和脂肝合剂冻干粉组HepG2细胞内的TG及脂滴含量明显减少。
实验三
一、脂肝合剂含药血清改善FFA诱导HepG2细胞脂质沉积
1.HepG2细胞甘油三酯(TG)水平测定
用1000μM FFA刺激小鼠原代HepG2细胞24h后，用GPO-PAP酶法检测细胞内TG含量，油红0染色检测胞质内的脂滴含量。结果显示:与对照组比较，FFA刺激组细胞内的TG含量明显增加((P＜0.01))，且脂滴数量明显增多，部分细胞内有脂滴融合现象。
2.HepG2细胞油红0染色
正常组HepG2细胞内未见脂滴，FFA组经FFAlmM处理24小时后，脂滴含量明显增多;与FFA组比较，脂肝合剂干预后细胞内脂肪特异性着色区域也随之减少，细胞内油红0特异性着色区域大小依次顺序为:FFA组＞5％MS＞10％MS＞15％MS＞20％MS＞正常组。
二、脂肝合剂含药血清改善FFA诱导HepG2细胞脂肪酸代谢相关蛋白表达
1.HepG2细胞Western blot
1)脂肪酸β氧化
与正常组比较，FFA组AMPKa、p-AMPKa、CPT—l、PGC—la表达明显降低，有显著差异((P＜0.01))，与FFA组相比，脂肝合剂含药血清各组(5％MS、10％MS、15％MS、20％MS)HepG2细胞内的AMPKα、p-AMPKα、CPT-1、PGC-1α蛋白明显表达升高。
2)脂质生成
与正常组比较，FFA组SREBP-1C、FAS、ACC表达明显升高，有显著差异((P＜0.01))，与FFA组相比，脂肝合剂含药血清各组(5％MS、10％MS、15％MS、20％MS)SREBP-1C、FAS、ACC蛋白明显表达下降:差异具有统计学意义。
2.转录因子SREBP-1C免疫荧光检测
与正常组比较，FFA组SREBP-1C表达明显升高，差异具有显著性，与FFA组相比，5％MS组SREBP-1C表达差异不明显，10％MS组SREBP-1C表达有下调趋势，15％MS、20％MS组SREBP-1C表达下调明显且20％MS组优于15％MS组。
结论:
本课题研究得出以下结论
1.脂肝合剂虽未能在治疗期间显著减轻NAFLD模型小鼠的体重增长，但能降低小鼠肝指数，改善NAFLD高瘦素血症和脂肪组织细胞病理结构;明显降低NAFLD模型动物血清脂质:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度酯蛋白(LDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)的水平，且有效降低血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，减轻肝细胞损伤，以上疗效与脂肝合剂临床疗效预期相符。
2.脂肝合剂减少NAFLD肝细胞内脂质沉积，改善肝脏病理学情况，治疗非酒精性脂肪性肝病，可能与激活AMPK，增加AMPK的磷酸化水平，下调NAFLD模型小鼠肝组织的SREBP-1C、FAS表达，抑制脂质的生成，上调PGC-1α、CPT-1的表达，促进脂肪酸转运至线粒体增加脂肪酸的p氧化，纠正NAFLD脂肪酸代谢异常有关。
3.脂肝合剂不仅水提物冻干粉具有减轻肝细胞脂质沉积作用，脂肝合剂含药血清(入血成分)同样可以发挥减轻肝细胞脂质沉积的作用，这对于本研究团队运用中药复方生物药代动力学-药效动力学(PK-PD)研究手段探讨脂肝合剂复方的药理作用有着重要的指导意义。
本课题研究采用体内与体外模型结合，以中药复方脂肝合剂干预高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFLD模型，以及复方冻干粉、含药血清干预游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂肪变性的NAFLD细胞模型进行研究，明确复方脂肝合剂对非酒精性脂肪性肝病肝细胞脂质沉积的治疗作用及其相关机制。
方法:
实验一:脂肝合剂改善高脂饲养诱导NAFLD模型小鼠肝脏脂质沉积作用机制研究
1.脂肝合剂水煎剂制备
中药复方脂肝合剂由山楂、郁金、黄芪、柴胡、丹参、决明子等组成，将上述中药按照比例称取，加入10倍量水煎煮提取2次，每次1.5小时，合并两次提取液，过滤，将其浓缩成59/ml生药的药液，50ml离心管分装，-20℃保存备用。
2.雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组、普罗布考阳性药对照组，每组10只，除正常组外，其余各组均给予含60％kcal的高脂饲料喂养12周，建立NAFLD模型，分别以低剂量(1.25g/ml)、高剂量(5g/m1)脂肝合剂或普罗布考(500mg/kg)灌胃，2次/日，连续给药8周，正常组给予生理盐水灌胃作空白对照，干预结束后，各组小鼠称重后取材，摘取脂肪、全肝组织，称重，分装，-80℃保存。
3.指标检测
1)自药物干预起，每两周记录动物体重。
2)药物干预结束后，记录各组小鼠体重、取材并记录全肝重量，计算肝指数。
3)血清试剂盒检测各组小鼠血脂四项、游离脂肪酸水平和肝功能水平。
4)酶联免疫吸附(ELISA)检测各组小鼠血清瘦素(Leptin)表达情况
5)H&E染色观察各组小鼠肝组织、白色脂肪组织病理情况。
实验二:脂肝合剂冻干粉改善游离脂肪酸诱导HepG2细胞脂质沉积作用机制研究
1.脂肝合剂冻干粉制备:将预先准备的脂肝合剂水煎剂放于一次性无菌培养皿内，放入冷冻真空干燥机内，干燥至少24小时，将真空干燥后的脂肝合剂水提物冻干粉迅速收集并低温保存。
2.细胞培养
HepG2细胞按每孔3×105个的密度接种于6孔板内，每孔加入2ml含10％FBS+1％青链霉素的DMEM高糖完全培养基，实验为5组:正常对照组、FFA模型组、FFA+脂肝合剂组、FFA+AMPK激活剂组、FFA+AMPK抑制剂组，细胞贴壁24小时后，去原培养基，除正常组外，各组加入以DMEM高糖培养基稀释终浓度为lmM的FFA造模液和对应药物的混合物共培养24小时。继续进行后续实验。
实验三:脂肝合剂含药血清改善游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂质沉积作用机制研究
1.脂肝合剂含药血清制备:10周龄雄性SD大鼠20只，体重约330-3609)，随机分为正常组及给药组，分别给予中药复方脂肝合剂和生理盐水灌胃，每次按1ml/100g大鼠体重分别进行灌胃，2次/日，连续1周。各组大鼠最后1次灌胃2小时后，2％戊巴比妥麻醉，腹主动脉采血，3500rpm，15分钟，离心分离含药血清和对照血清。将每组10只大鼠血清分别混合，56℃水浴30分钟灭活，0.22μm过滤后分装置-80℃冰箱保存备用。
2.细胞培养:HepG2细胞按每孔3×105个的密度接种于6孔板内，每孔加入2ml含10％FBS+1％青链霉素的DMEM高糖完全培养基，实验为6组:正常大鼠血清对照组、FFA组、FFA+5％MS组、FFA+10％MS组、FFA+15％MS组、FFA+20％MS组，细胞贴壁24小时后，去原培养基，加入用DMEM高糖培养基稀释终浓度为lmM的FFA造模液培养24小时，去造模液，加入含有不同浓度含药血清和2％青链霉素配制的DMEM完全培养基培养24h。继续进行后续实验。
结果:
实验一
一、脂肝合剂虽未能明显减轻NAFLD小鼠体重但能改善肝指数
1.体重与肝指数
①与正常组比较，模型组体重明显增加，差异具有显著性P＜0.01。药物干预前，HFD模型组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组、普罗布考阳性对照组各组间小鼠体重差异不具有统计学意义。
②肝指数
正常组小鼠肝指数最低，HFD模型组小鼠肝指数最高，两组间比较差异具有统计学意义。组间比较显示，普罗布考组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组与HFD模型组比较，差异均具有显著性(P＜0.01)。
二、脂肝合剂改善NAFLD小鼠脂肪组织病理及瘦素水平
1.酶联免疫吸附(ELISA)检测血清瘦素(Leptin)结果提示:与正常组比较，HFD模型组血清瘦素水平明显升高，差异具有显著性(P＜0.01)，与模型组比较，仅复方高剂量组瘦素水平下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.H&E染色观察各组小鼠白色脂肪组织病理情况
正常组小鼠白色脂肪组织细胞排列紧密，体积匀称，大小均匀，HFD模型组白色脂肪细胞体积明显增大，呈椭圆或圆形，排列疏松，脂肝合剂各剂量组白色脂肪细胞较HFD模型组均有明显改善，脂肪细胞体积明显缩小且排列较紧密。普罗布考组虽有改善，但不如脂肝合剂高剂量组明显。
三、脂肝合剂改善NAFLD小鼠肝脏脂质沉积
1.血清脂质水平
与正常组比较，模型组血脂水平明显增高，差异具有显著性(P＜0.01);与模型组比较，各干预组血清TC、TG、LDL-C、NEFA均有不同程度的下降，差异具有显著性(F=46.6，P=0.000;F=7.617，P=0.000;F=22.486，P=0.000;F=13.891，P=0.000)。
2.H&E染色观察肝脏病理情况
高脂饮食诱导NAFLD组小鼠肝脏肝细胞体积增大，部分肝细胞呈气球样变，胞内可见明显空泡，细胞核被胞内脂质挤至偏向细胞膜。普罗布考阳性药对照组小鼠肝细胞排列较模型组紧密，肝细胞形态未见明显异常，胞内散在脂质沉积，低剂量组小鼠肝内仍可见部分肝细胞呈空泡状，胞内脂质沉积明显，高剂量组小鼠肝细胞排列较紧密，胞核居中，细胞未见明显脂质沉积及肝细胞气球样改变，仅可见肝细胞间留有少许空隙。
四、脂肝合剂改善NAFLD小鼠血清肝功能损害
高脂喂养12周，NAFLD模型小鼠血清肝功能表现为ALT表达持续升高且高于AST为主要表现。经脂肝合剂口服给药干预后，各干预组小鼠血清肝功能水平均有不同程度的下降，其中以脂肝合剂高剂量组最为明显。
实验二
一、FFA诱导HepG2细胞脂肪变性细胞模型浓度筛选。
当FFA浓度处于2mM，细胞活力明显抑制，提示该浓度下的FFA具有细胞毒性，故本次实验选择FFA浓度为1mM，用于后续实验。
二、脂肝合剂冻干粉药物干预浓度筛选
MTT结果显示:当ZGLP浓度超过1000μg时，存在明显细胞毒性，细胞存活率下降明显(P＜0.05)。为了降低ZGLP对肝细胞的毒性作用，我们选取1000μg作为ZGLP的最佳药物干预浓度，用于后续实验。
三、AMPK激活剂、抑制剂药物干预浓度筛选
MTT结果显示:与对照组比较，当AICAR浓度超过2mM时;Doxorubicin hydrochloride浓度超过2μM，开始存在明显细胞毒性，细胞存活率下降明显(P＜0.05)。因此，我们选取AICAR(1mM)、Doxorubicin hydrochloride(1μM)作为最佳药物干预浓度，用于后续实验。
四、脂肝合剂和抑制及激活KMPK表达对HepG2细胞脂质沉积的影响
1.GPO-PAP法检测HepG2细胞内TG含量
与对照组比较，FFA组与AMPK抑制剂(DOX)组HepG2细胞内TG含量明显增加(P＜0.01));与FFA组比较，AMPK激活剂(AICAR)组和脂肝合剂冻干粉组HepG2细胞内的TG含量明显减少。
2.油红0染色
正常组HepG2细胞内未见脂滴，FFA组经FFAlmM处理24小时后，脂滴含量明显增多;AMPK抑制剂(DOX)组HepG2细胞内脂滴明显，部分有脂滴融合现象;与FFA组比较，AMPK激活剂(AICAR)组和脂肝合剂冻干粉组HepG2细胞内的TG及脂滴含量明显减少。
实验三
一、脂肝合剂含药血清改善FFA诱导HepG2细胞脂质沉积
1.HepG2细胞甘油三酯(TG)水平测定
用1000μM FFA刺激小鼠原代HepG2细胞24h后，用GPO-PAP酶法检测细胞内TG含量，油红0染色检测胞质内的脂滴含量。结果显示:与对照组比较，FFA刺激组细胞内的TG含量明显增加((P＜0.01))，且脂滴数量明显增多，部分细胞内有脂滴融合现象。
2.HepG2细胞油红0染色
正常组HepG2细胞内未见脂滴，FFA组经FFAlmM处理24小时后，脂滴含量明显增多;与FFA组比较，脂肝合剂干预后细胞内脂肪特异性着色区域也随之减少，细胞内油红0特异性着色区域大小依次顺序为:FFA组＞5％MS＞10％MS＞15％MS＞20％MS＞正常组。
二、脂肝合剂含药血清改善FFA诱导HepG2细胞脂肪酸代谢相关蛋白表达
1.HepG2细胞Western blot
1)脂肪酸β氧化
与正常组比较，FFA组AMPKa、p-AMPKa、CPT—l、PGC—la表达明显降低，有显著差异((P＜0.01))，与FFA组相比，脂肝合剂含药血清各组(5％MS、10％MS、15％MS、20％MS)HepG2细胞内的AMPKα、p-AMPKα、CPT-1、PGC-1α蛋白明显表达升高。
2)脂质生成
与正常组比较，FFA组SREBP-1C、FAS、ACC表达明显升高，有显著差异((P＜0.01))，与FFA组相比，脂肝合剂含药血清各组(5％MS、10％MS、15％MS、20％MS)SREBP-1C、FAS、ACC蛋白明显表达下降:差异具有统计学意义。
2.转录因子SREBP-1C免疫荧光检测
与正常组比较，FFA组SREBP-1C表达明显升高，差异具有显著性，与FFA组相比，5％MS组SREBP-1C表达差异不明显，10％MS组SREBP-1C表达有下调趋势，15％MS、20％MS组SREBP-1C表达下调明显且20％MS组优于15％MS组。
结论:
本课题研究得出以下结论
1.脂肝合剂虽未能在治疗期间显著减轻NAFLD模型小鼠的体重增长，但能降低小鼠肝指数，改善NAFLD高瘦素血症和脂肪组织细胞病理结构;明显降低NAFLD模型动物血清脂质:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度酯蛋白(LDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)的水平，且有效降低血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，减轻肝细胞损伤，以上疗效与脂肝合剂临床疗效预期相符。
2.脂肝合剂减少NAFLD肝细胞内脂质沉积，改善肝脏病理学情况，治疗非酒精性脂肪性肝病，可能与激活AMPK，增加AMPK的磷酸化水平，下调NAFLD模型小鼠肝组织的SREBP-1C、FAS表达，抑制脂质的生成，上调PGC-1α、CPT-1的表达，促进脂肪酸转运至线粒体增加脂肪酸的p氧化，纠正NAFLD脂肪酸代谢异常有关。
3.脂肝合剂不仅水提物冻干粉具有减轻肝细胞脂质沉积作用，脂肝合剂含药血清(入血成分)同样可以发挥减轻肝细胞脂质沉积的作用，这对于本研究团队运用中药复方生物药代动力学-药效动力学(PK-PD)研究手段探讨脂肝合剂复方的药理作用有着重要的指导意义。