复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)是妇科常见的妊娠并发症，随着社会的日益发展，晚婚晚育和大龄孕妇日益增多，RSA的发病率呈逐年增加趋势。RSA的防治也成为妇产科医生和生殖免疫学家的需要解决的迫切问题。临床虽有多种治疗方法，但疗效不甚满意。其发病因素极其复杂，其中自身免疫因素居首位占65％以上，因此，从免疫学方面探讨治疗RSA新方法是一条新策略。　　 目前，根据RSA的病因不同，治疗方案也不同：(1)对于封闭抗体缺乏的RSA，主要采用丈夫或无关个体淋巴细胞皮下多点注射进行主动免疫治疗和静脉滴注丙种球蛋白进行被动免疫治疗；(2)对自身免疫型RSA，多采用小剂量阿司匹林加肝素治疗；国内学者也有应用中药复方加小剂量阿司匹林治疗。近来，国外学者开始应用地屈孕酮和活性Vitamin D3治疗RSA。所有以上治疗均取得一定疗效，但也存在争议。　　 现有的研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)在人类许多疾病中起着至关重要的作用，有可能作为潜在的治疗手段。通过下调Treg细胞数量和功能可以用于癌症和感染治疗；通过上调Treg细胞数量和功能可以用于治疗变态反应性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和诱导移植耐受。越来越多的证据表明，RSA患者体内CD4+CD25+Treg数量和功能明显下降，使得Th1型免疫应答过强，导致流产发生。因此，通过人为补充体内Treg细胞有可能用于治疗RSA。CD4+CD25+Treg细胞治疗RSA理论上可以避免现有治疗方法如主动免疫治疗和IVIG被动免疫治疗的局限性，具有更广的应用前景。本研究拟构建新型培养体系获得可在体外长期培养的Treg细胞克隆；鉴定Treg细胞的表型和功能；在体外探讨Treg细胞对RSA患者外周血免疫细胞的免疫抑制功能。　　 第一部分 脐血和成人外周血中Treg细胞的表型及频率比较　　 [目的]　　 由于人脐血容易获得，是Treg细胞体外培养潜在的标本来源，但对脐血与成人外周血Treg细胞的表型和功能差异知之甚少，本研究的目的是比较脐血和成人外周血中Treg细胞的表型及频率，为Treg细胞体外培养选择合适的标本来源。　　 [方法]　　 密度梯度离心法分离15例新生儿脐血和12例正常健康成人外周血，应用流式细胞术分析Treg细胞中CD45RA、CD45RO及胞内抗原Foxp3的表达情况；检测CD4+CD25bright/CD4+T和CD4+CD25dim/CD4+T的百分比。　　 [结果]　　 与成人外周血相比，脐血CD4+CD25+T显示为独立的细胞群，与CD4+CD25-T细胞很容易区分；而成人的CD4+CD25+和CD4+CD25+T细胞则是连续的细胞群。在表型上，脐血CD45RA+细胞占CD4+CD25+T细胞的(73.1±4.4)％；CD45RO+细胞占CD4+CD25+T细胞的(27.3 ±1.3)％。成人CD45RA+细胞占CD4+CD25+T细胞的(54.5±3.9)％；CD45RO+细胞占CD4+CD25+T细胞的(46.1±2.5)％。脐血中CD4+T细胞百分比及绝对计数均较成人外周血明显增高，CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25brightT细胞的绝对计数较成人外周血明显增高，但是CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25brightT细胞占CD4+细胞的百分比较成人外周血减低(P<0.001)。脐血CD4+CD25bright、CD4+CD25+T细胞中Foxp3频率明显较成人外周血中的低(P<0.001)。　　 [结论]　　 与成人外周血相比，脐血中存在数量较多的Treg细胞，但功能尚未成熟，可能更适合作为调节性T细胞体外培养的标本来源。　　 第二部分 人脐血Treg细胞的分离及体外培养体系建立　　 [目的]　　 由于Treg细胞具有较强的免疫抑制功能，但其在人外周血中含量较低，限制其在临床上进一步应用，本研究的目的是构建Treg细胞体外培养体系，进一步鉴定培养后的Treg细胞的表型。　　 [方法]　　 应用免疫磁珠分离系统分离脐血Treg细胞，流式细胞术分析Treg细胞纯度。脐血Treg细胞中按细胞/磁珠比例为1：2加入抗CD3/CD28包被的磁珠共孵育，加入500U/ml重组人IL-2，每隔3天换一次液，培养到第12天，再加入100U/ml重组人IL-2，继续培养。分别在培养第5天、15天和25天，应用光学显微镜观察细胞生长状态；并进行细胞计数;应用流式细胞术鉴定培养第25天后Treg细胞表型。　　 [结果]　　 应用免疫磁珠分离系统经过“阴性选择”获得CD4+T细胞，流式细胞分析其纯度达99.8％；分离纯化前脐血Treg细胞占CD4+T细胞的8.8％；应用免疫磁珠分离系统一次分离脐血Treg细胞，纯度可达99％。在光学显微镜下，观察第5天细胞较少，数量约1.5×105个；第15天，细胞数较多，数量约为9×106个；第25天细胞明显增多，数量约为1.6×107个。Treg细胞培养第25天后，流式细胞术分析其表型，发现表达CD4+、CD25+的T细胞频率为95％，即培养后细胞中Treg细胞占95％。　　 [结论]　　 应用免疫磁珠分离系统可获得较高纯度的Treg细胞，体外培养可获得较多的Treg细胞，且维持原有的表型特征。　　 第三部分 扩增后Treg细胞抑制复发性流产患者免疫细胞功能研究　　 [目的]　　 主动和被动免疫疗法确有提高母胎免疫耐受、防止流产的疗效，但尚不够理想。因此，可以考虑从不同的环节采取不同的方法，探索诱导母胎免疫耐受的新疗法，从而开辟因为不明复发性流产免疫治疗的新途径。本研究应用扩增后Treg细胞对复发性流产患者免疫细胞功能影响，为临床上治疗复发性流产提供实验基础。　　 [方法]　　 将培养25天后Treg细胞按抑制/效应细胞比为10：1、4：1、2：1和1：1与复发性流产患者外周血PBMC共培养5天，应用MTT法检测Treg细胞对复发性流产患者外周血PBMC增值的抑制作用；应用ELISA法检测培养上清中IFN-γ和IL-10水平。　　 [结果]　　 应用同种淋巴细胞混合反应检测培养后Treg细胞对RSA患者外周血PBMC功能的影响，我们发现单独加Treg对照的OD值为(0.22±0.02)；单独加PBMC对照的OD值为(1.49±0.07)；当抑制/效应比为10：1时，测得OD值为(O.41±0.05)；当抑制/效应比为4：1时，测得OD值为(0.47±0.06)，；当抑制/效应比为2：1时，测得OD值为(0.75±0.05)，此时Treg细胞的抑制率达到50％；当抑制/效应比为1：1时，测得OD值为(0.91±0.04)。当抑制/效应比为10：1时，IFN-γ、IL-10浓度分别为(16.7±2.2)、(128.3±9.6)pg/ml；当抑制/效应比为4：1时，IFN-γ、IL-10浓度分别为(43.0±3.9)、(93.1±2.6)pg/ml；当抑制/效应比为2：1时，IFN-γ、IL-10浓度分别为(68.3±2.8)、(73.1±2.9)pg/ml；当抑制/效应比为1：1时，IFN-γ、IL-10浓度分别为(90.6±5.3)、(38.5±3.7)pg/ml。　　 [结论]　　 培养扩增后Treg细胞能在体外有效抑制复发性流产患者外周血PBMC增值作用，并能使外周血中IFN-γ水平下降，IL-10水平升高，有利妊娠维持。