P16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，作为多重肿瘤抑制因子家族的一员，在分子生物学领域中与肿瘤相关研究较多，有大约75％以上的人类恶性肿瘤发生了P16基因的缺失、突变、异常的基因沉默或蛋白的功能性失活，其频率超过P53在各种肿瘤中的改变。P16参与肿瘤的形成和发展主要是通过调控细胞周期检测点，使细胞周期停滞于G<,1>期而无法进入S期。近年来的研究表明，P16的转录变异体之一，P16INK4A除了具有以上主要的生物学功能之外，还与其他的细胞进程有关，如细胞衰老和细胞自我更新。P16INK4A表达的增加或者活性的增强对于衰老细胞的功能下降起促进作用；而P16INK4A活性的下降可以显著地增强细胞的增殖和更新能力。在哺乳动物细胞的生命进程中，细胞的衰老和自我更新可能与一些未知的P16INK4A相互作用蛋白有关。基于此，对P16INK4A的作用通路及相关蛋白的研究是目前的研究热点，将有助于揭示P16INK4A参与多种细胞进程尤其是细胞自我更新和衰老的分子机制，也可能为肿瘤的防治提供新的周期调控分子靶点。本研究以P16INK4A结合蛋白的筛选作为其功能研究的切入点。 首先构建了表达P16INK4A与GAL4-BD融合蛋白的酵母细胞表达，以P16INK4A为诱饵，应用MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3，筛选预转入酵母Y187的成体人肝脏cDNA文库。选择1548个克隆进行序列分析，经过剔除和合并得到148种不同cDNA序列。根据序列重复出现的次数和蛋白质性质，选择了NICE3、eTIF3、HSPC209、SBP、BTBD6和ISOC2共计6个蛋白进行下一步的验证工作。 进一步构建真核表达载体pCMV-HA-NICE3、pCMV-HA-HSPC209、pCMV-HA-BTBD6、pCMV-HA-SBP、pCMV-HA-ISOC2、pCMV-HA-TIF3，分别与pCMV-Myc-P16共转染HEK293细胞。应用Co-immunoprecipitation方法制备固相免疫复合物，样品经SDS-PAGE分离后用anti c-Myc antibody进行Western Blot检测。结果显示P16INK4A只能与ISOC2共沉淀，即在细胞内P16INK4A只能与ISOC2结合，验证并鉴定了酵母双杂交的结果。 为进一步鉴定P16INK4A与ISOC2发生结合的确定性和特异性，构建了原核表达载体pGEX-6p-P16，同时利用研究室自有的PQE30-P16原核表达载体，在体外大量表达和纯化GST-p16和6×His-p16蛋白，应用Pull-down技术结合并沉淀ISOC2蛋白，沉淀后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用anti HA antibody进行Western Blot检测。结果显示经过体外表达的P16INK4A能够直接与ISOC2特异性地发生相互作用。 ISOC2基因位于人类染色体19q13.42，对ISOC2基因进行的生物信息学分析显示，该基因在进化上高度保守。ISOC2蛋白一级结构由205个氨基酸残基组成，富含亮氨酸，内含一个异分枝酸酶结构域，位于蛋白质的C端，据预测其功能可能与异分枝酸酶类似，具有代谢酶的功能，但同时可能还有蛋白结合能力，ModBase对该蛋白的三级结构预测显示在蛋白的N端有多个螺旋-环-螺旋结构，提示该蛋白具有与其他蛋白结合的功能。 为检测ISOC2在细胞中的定位，构建了pEYFP-P16和pECFP-ISOC2载体，在激光共聚焦显微镜下观察到单独表达的CFP-ISOC2融合蛋白信号弥散分布于整个细胞质，而与YFP-P16INK4A融合蛋白共表达的ISOC2荧光信号集中分布于细胞核区域，与P16INK4A荧光信号分布高度一致。平行转染HEK293也得到了相同的结果。 综上，本研究用充足的实验室证据首次鉴定了一个新的P16INK4A相互作用蛋白——ISOC2。其与P16INK4A相互伴行分布的特点提示该蛋白可能作为一个重要的信号分子参与细胞生命活动的进程。