第一部分诊断超声联合微泡对高糖培养的人脐静脉内皮细胞活性的影响及机制研究背景糖尿病（diabetes mellitus,DM）是一种高糖状态引起的内分泌代谢性疾病,可以导致内皮功能障碍、心肌纤维化及氧化应激,加快动脉粥样硬化的进程以及内源性的心肌细胞损害最终引起与高血压、冠心病等无关的心肌结构和功能改变的特异性心肌病变,称之为糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）,其病理学基础是血管病变。血管内皮细胞位于血管内壁,维持血管壁的完整性及稳态直接影响DCM的病程进展。研究表明体外高糖状态下可以导致血管内皮细胞凋亡,破坏内皮细胞的完整性,PI3K-Akt-eNOS通路可能参与了糖尿病内皮细胞功能紊乱,因此,积极研究开发能够改善血管内皮功能,抑制血管内皮细胞凋亡的方法对于遏制人类DCM发生发展具有积极意义。诊断超声（diagnostic ultrasound,DUS）是一种安全应用于临床的低强度超声（low intensity ultrasound,LIUS）。超声靶向微泡破裂技术（ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD）是由超声微泡造影剂携带药物/基因在超声波的作用下实现定位爆破,靶向释放药物和基因载体,从而达到对疾病的治疗目的,是一种新兴的无创性药物/基因靶向递送技术。LIUS及其联合微泡（microbubble,MB）可刺激机体内源性血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的合成与分泌,诱导血管新生,成为一种治疗缺血性疾病的有效治疗方法。本研究从细胞水平探讨DUS联合MB能否增加高糖状态培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）迁移活性,并探索其是否是通过激活PI3K-Akt-eNOS信号转导通路发挥保护作用,为该技术向临床转化提供一定的理论支持。目的观察DUS联合MB对高糖状态下HUVECs迁移能力的影响及对PI3K、AKT、eNOS蛋白表达的影响,探讨其对HUVECs迁移活性的影响及可能分子机制。方法我们选择利用高糖培养基（35mmol/L glucose）孵育HUVECs 24 h,建立高糖损伤下的HUVECs模型。将细胞分为正常组（Normal组）、微泡组（MB组）、高糖组（Glucose组）、超声空化组（VFLASH组）,进行细胞划痕实验评估细胞迁移性,应用免疫荧光法对细胞PI3K、Akt、eNOS表达蛋白进行荧光标记。超声照射参数我们参照前期细胞量效-时效实验确定的辐照有效参数:脉冲宽度（pulse length,PL）:3.0cycle、声功率 50%、机械指数（mechanical Index,MI）0.82、时间1min。结果内皮细胞迁徙率有明显的时间依赖性,随时间的延迟,迁徙率呈明显的上升趋势。MB组与normal组在同一观察时间点细胞迁移率差异无统计学意义（均P＞0.05）。3h、6h、9h和12h观察点Normal组内皮细胞迁移性与Glucose组比较差异有统计学意义（P=0.045;P=0.003;P=0.004;P＜0.001）。VFLASH 组在6h、9h和12h三个观察时间点内皮细胞迁徙率明显升高,与Glucose组之间存在显着性差异（P=0.04;P=0.033;P=0.047）。用免疫荧光法对细胞标志蛋白进行荧光标记,发现Normal组和MB组PI3K、Akt、eNOS表达差异无统计学意义（均P=1.000）。Glucose组的PI3K、Akt、eNOS表达均明显低于Normal组和MB组,差异有统计学意义（均P＜0.001）。VFLASH组PI3K、Akt、eNOS表达明显增多,与Glucose组比较有显着性差异（P＜0.001;P=0.003;P＜0.001）。VFLASH组PI3K和eNOS与Normal组比较差异无统计学意义（P=0.149;P=0.229）,Akt表达与Normal组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。结 论1.高糖状态下,HUVECs细胞活性减低,细胞迁移能力明显低于正常组。加入微泡造影剂后并不明显影响细胞活性,该造影剂对于内皮细胞作用是安全的。2.DUS联合MB可以增加高糖状态下HUVECs细胞迁移活性,其机制可能与激活PI3K-Akt-eNOS信号传导通路有关,为其向临床转化提供理论支持。第二部分 诊断超声联合微泡对糖尿病心肌病大鼠心肌功能及微循环的改善作用背景微血管功能不全在DCM的发生发展中起着重要作用,主要表现为微循环解剖功能异常,引起心肌灌注减少,心功能降低。治疗性血管生成主要用于缺血性疾病的治疗,然而在未来的临床应用中,尚缺乏安全高效的传递系统。血管生成主要由内皮细胞激活开始,然后增殖、迁移,并在已有的小血管中促进新的毛细血管生成的过程。在第一部分研究中,我们发现高糖状态下DUS联合MB可以明显改善高糖状态下内皮细胞的细胞活力和迁移力,保护内皮细胞,调节血管生成。本研究应用DUS联合SonoVue微泡造影剂观察其能否促进大鼠DCM的心肌微血管新生,改善心肌微循环,从而达到有效治疗糖尿病心肌病的目的,为糖尿病心肌病的治疗研究提供一种新的思路和无创、有效、安全、便捷的新方法。目的本研究观察SonoVue微泡（MB）联合超声（ultrasound,US）对DCM大鼠心肌功能的干预治疗效果,观察不同空化参数对心肌血管生成的影响,并初筛出改善DCM心肌微循环的最佳超声空化治疗参数。资料与方法用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）腹腔注射雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠并给予高脂高糖饲料喂养诱导DCM大鼠模型。通过对大鼠血糖进行检测,并通过心肌及胰腺形态学变化判断DCM模型是否构建成功。将大鼠分为正常对照组（normal组）、DCM模型组（DCM model组）、超声治疗组（US+MB组）,而US+MB组根据不同超声脉冲宽度（pulse length,PL）又分为8cycle组、18cycle组、26cycle组、36cycle组。干预完成后,所有大鼠均接受常规超声心动图检查心功能。处死大鼠,取部分心脏组织进行心肌组织HE染色观察心肌结构改变,Masson胶原染色并进行心肌胶原容积分数（collagen volume fraction,CVF）评估了解心肌纤维化情况,透射电镜观察心肌组织微血管超微结构改变评估US+MB对DCM大鼠心肌微血管的保护作用,并用免疫组化法对新生血管标记物CD31进行标记评估心肌微血管密度（myocardial capillary density,MCD）,检测US+MB对DCM大鼠心肌微血管生成的改善作用。结果成功构建了 DCM大鼠模型,病理结果显示DCM model组心肌细胞肥大、纤维化、灶性坏死等病理改变,心肌纤维化明显,CVF明显增加,与normal组有显着性差异（P＜0.001）,心肌内小动脉内皮细胞增生、变性,炎症细胞浸润,心肌毛细血管腔变窄,基底膜增厚。经过两周的干预治疗后,US+MB组的大鼠心肌肥厚、纤维化及心肌细胞病变明显减轻,26cycle组和36 cycle组胶原纤维明显减少,与normal比较CVF差异无统计学意义（P=0.450;P=0.534）。电镜下观察心脏微血管超微结构变化,发现DCM model组心肌小动脉不光滑,连续性缺失;内皮细胞膜不完整,细胞核异染色质增加、边聚,呈损伤状态。US+MB干预后DCM大鼠心肌小动脉受损情况有所改善。常规超声心动图结果显示各组的LVIDd和IVS差异无统计学意义（F=0.567,P=0.725;F=1.053,P=0.394）,DCM model 组大鼠 LVEF、LVFS 指标明显低于normal 组（P=0.002;P＜0.001）。与 DCM model 组相比,US+MB 组的各项心功能指标均有不同程度的改善,26 cycle组的LVEF、LVFS与normal组比较差异无统计学意义（P=0.557;P=0.463）。心肌组织MCD检测结果显示DCM模型组心肌组织MCD较normal对照组明显降低（P＜0.001）,US+MB干预各组大鼠心肌组织MCD较DCM model组略有增加,26 cycle组增加最为明显,与DCM model组比较差异有统计学意义（P＜0.001）,与normal组差异无统计学意义（P=0.625）。结论1、从形态学和超声心动图上看,DCM大鼠心肌结构较正常大鼠出现一系列异常,进一步验证了高糖状态对大鼠心肌的损伤。2、US+MB联合作用可以对DCM大鼠心脏产生保护作用,减轻心肌纤维化水平,改善心肌的结构与功能,26 cycle组对其治疗作用较明显,这可能与其增加心肌微循环灌注有关。3、US+MB联合应用可以提高血管生成的疗效,改善修复新生血管增加心脏灌注,特别是使用26 cycle时可逆转心功能障碍,延缓心肌病变进程,这一联合策略可能为糖尿病患者DCM的早期干预提供一种新的方法。第三部分 诊断超声联合微泡对糖尿病心肌病大鼠心肌微循环改善的可能机制研究背景DCM是高糖状态所致的代谢紊乱对心肌微血管损伤所致,可以导致微血管功能受损,因此促进心肌血管新生对于改善DCM心肌功能有重要意义。LIUS及其联合MB可诱导血管新生,已经被用于治疗缺血性心血管疾病。在第二部分研究中,我们观察到通过使用DUS联合SonoVue造影剂可以有效增加心肌MCD,促进DCM大鼠心肌的微血管新生,改善心肌收缩功能。目前该技术促进血管新生的确切机制仍未完全清楚。第一部分研究中发现LIUS联合MB可以通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路而促进HUVECs的血管新生。因此,我们推测DUS联合MB有可能通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路拮抗糖尿病内皮细胞损伤,促进心肌微血管新生,改善心肌微循环,增加心肌收缩力,最终改善心功能。目的本研究中通过免疫组化、Western Blotting等方法检测PI3K、Akt、eNOS的蛋白表达及磷酸化水平,探讨DUS联合MB对糖尿病心肌微循环改善可能的分子机制,为DCM的治疗研究提供新的思路和实验依据。资料与方法健康雄性SD大鼠通过腹腔注射STZ（65mg/kg）后高脂高糖饮食建立2型糖尿病心肌病大鼠模型。实验分为三个大组:正常对照组（normal组）、糖尿病心肌病模型组（DCM model组）、超声联合SonoVue微泡组（US+MB组）,而US+MB组根据前期研究结果选择26 cycle组超声参数。采用诊断超声VFLASH技术进行干预治疗,干预2周后处死后取出心肌组织,Western Blot法和免疫组化法检测大鼠心肌组织PI3K-Akt-eNOS通路蛋白的表达。结果Western Blotting 结果显示,与 normal 组比较,DCM model 组和 US+MB 组大鼠心肌组织PI3K、Akt、eNOS蛋白表达及磷酸化水平明显减低（均P＜0.001）。与DCM model组比较,US+MB组大鼠心肌组织PI3K、Akt蛋白表达量及PI3K蛋白的磷酸化水平明显增加（P=0.034;P=0.040;P=0.036）,Akt蛋白的磷酸化水平无明显差异（P=1.000）,eNOS及p-eNOS表达量略有增加,但差异无统计学意义（P=0.344;P=1.000）。免疫组化结果总体上显示,与normal组比较,DCM model组和US+MB组大鼠心肌组织PI3K、Akt、eNOS蛋白表达均明显减低,差异有统计学意义（均P＜0.001）。US+MB组大鼠心肌组织PI3K、eNOS表达水平高于DCM model组,差异有统计学（P=0.04;P=0.027）、Akt表达水平略高于DCM model组,差异无统计学（P=1.000）。结论1、高糖状态可以影响DCM大鼠心肌组织PI3K-Akt-eNOS信号通路蛋白的表达,进而影响心肌微血管灌注,导致心肌功能受损。2、DUS联合MB可能通过激活PI3K-Akt通路促进下游因子eNOS的合成和释放,增加心肌血管新生、提高心肌微血管密度,改善心肌微循环,从而保护心肌功能。