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第一部分:
靶向PTEN的shRNA真核表达载体的构建和鉴定
目的:构建靶向PTEN基因的短发卡RNA(shRNA)表达载体,并探讨该表达载体对目的基因PTEN的沉默效果。
方法:设计两条PTEN特异性shRNA编码序列和一条非特异性阴性对照序列,插入质粒pSilencer 2.1-U6 hygro中,进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的质粒通过脂质体转染人胚肺成纤维细胞系HELF细胞,同时以阴性对照质粒,转染试剂对照和无血清培养基转染HELF细胞分别作为阴性对照,转染质粒对照和空白对照,采用RT-PCR技术及蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测PTEN在mRNA水平及蛋白水平的表达变化.
结果:测序结果和酶切产物经琼脂糖凝胶检测证实成功构建了PTEN的shRNA真核表达载体。RT-PCR及Western Blotting结果显示:两条含有PTEN shRNA的质粒经转染入HELF细胞后在mRNA水平及蛋白水平均能明显的抑制PTEN的表达,其中以第二条即shRNA-PTEN2抑制效果最为明显。
结论:成功的构建了PTEN特异性shRNA真核表达载体,经鉴定其在成纤维细胞中具有干扰PTEN基因表达的功能,为进一步研究成纤维细胞中的PTEN基因表达在肿瘤形成和发展中的作用奠定了基础。
第二部分:
携带PTEN shRNA质粒的HELF对乳腺癌细胞系MDA-MB-231生物学特性的影响
目的:探讨PTEN基因表达受抑的成纤维细胞(HELFPTEN-)与乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养时,乳腺癌细胞在增殖、侵袭和转移上的生物学变化,揭示肿瘤微环境对肿瘤生物学特性影响的部分机制。
方法:将HELFPTEN-与乳腺癌细胞系MDA-MB-231共培养。(1)通过流式细胞仪对MDA-MB-231细胞进行Ki67检测,检测共培养体系对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响;(2)5-FU诱导肿瘤细胞凋亡,通过Annexin V/PI流式细胞仪检测共培养体系对MDA-MB-231细胞抗凋亡能力的影响;(3)通过明胶酶谱实验验证共培养体系的培养基中MMP蛋白的表达变化以及MMP活性率的改变;(4)通过Transwell小室法,明确共培养体系对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响;(5)用Matrigel模拟并重建基底膜,通过Transwell小室法,建立成纤维细胞HELFPTEN-与乳腺癌细胞MDA-MB-231的交互作用模型,观察 HELFPTEN-对乳腺癌细胞侵袭转移的影响。
结果:(1)与HELFPTEN-共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231其Ki67表达较空白培养组和“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组显著增高(p<0.05)。(2)流式细胞仪检测发现与HELFPTEN-共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231具有拮抗5-FU诱导的细胞凋亡的作用,凋亡率明显低于空白培养组和“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组 (p<0.05)。(3)明胶酶谱实验检测发现HELFPTEN-以及乳腺癌细胞系MDA-MB-231共培养的培养基中MMP蛋白的表达和MMP活性率均明显高于空白培养组和“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组(p<0.05)。(4)Transwell迁移实验发现,迁移的细胞数呈现以下趋势:与HELFPTEN-共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231>“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组>MDA-MB-231细胞普通培养组,其差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)侵袭转移能力比较发现:与HELFPTEN-共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231>“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组>MDA-MB-231细胞普通培养组,其差异具有统计学意义(p<0.05)。
结论:成纤维细胞HELF可提升乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵袭转移能力,而PTEN表达受抑的HELF细胞,对MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵袭转移能力的增加影响更大,并可明显提升MMP蛋白的表达和活性率。因此,成纤维细胞中的抑癌基因PTEN有望成为肿瘤治疗干预的新靶点。