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细菌耐药已成为危害全球公共卫生的严重问题。近年来全球抗生素的使用量不断增加,细菌耐药的发生与传播越来越严重,目前几乎所有的病原菌均呈现出抗生素耐药性,给全球医疗体系带来巨大的经济和社会负担。不幸的是,新型抗生素的开发远远赶不上耐药菌增长的速度,且随着抗生素使用量的大幅增加,出现细菌耐药性的时间也更为短暂。抗菌肽是开发新型抗生素的重要候选者。它们由宿主表达以消除入侵的病原体并增强免疫应答。其中人中性粒细胞蛋白(human neutrophil protein-1,HNP-1)是人中性粒细胞的主要抗菌肽分子,主要存在于人中性粒细胞的溶酶体颗粒内,是迄今发现含量最多的杀菌分子。HNP-1具有广泛的抗菌谱和极强的抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及腺病毒、流感病毒、艾滋病毒等均有很强的杀伤活性,有可能成为新一代抗菌药物,有助于解决细菌的耐药性和抗生素的毒副作用等问题。尽管HNP-1有广阔的应用前景,天然获取HNP-1的量极其有限,而化学合成HNP-1则由于其分子内含有3对二硫键,难以保证多肽折叠时正确配对,从而影响其生物活性。因此,研究者尝试通过各种融合表达策略进行基因工程表达,但是效果仍然不理想,很难使HNP-1形成正确的折叠。本课题研究HNP-1在大肠杆菌中有效表达、成熟过程及其杀菌机制,研究内容和结论主要包括以下三个方面:1.在大肠杆菌BL21(DE3)表达全长HNP-1过程中,会激活产生有杀菌活性的mature HNP-1:(1)用tricine gel体系比较IPTG诱导前、后蛋白表达的差异,发现诱导后蛋白样品在3.4kD附近出现明显的条带,切胶质谱鉴定为mature HNP-1的肽段,并用top-down MS进一步确认了 mature HNP-1生成;(2)随着IPTG诱导时间的延长,mature HNP-1表达量逐渐升高,而对应的活细菌数目却显著减少;(3)根据mature HNP-1分子量较小的特点,采用3kD超滤管对诱导后的全蛋白溶液进行超滤,得到纯化的mature HNP-1蛋白;(4)分别用纯化的preproHNP-1和matureHNP-1加入菌液中检测生长曲线,显示preproHNP-1没有抑菌活性,而mature HNP-1具有抑菌作用。2.HNP-1能够诱发大肠杆菌BL21(DE3)产生细菌程序性死亡:(1)采用非标定量蛋白质组学技术鉴定HNP-1参与抑菌过程的蛋白,根据诱导前、后差异蛋白的功能聚类,并结合文献报道推测HNP-1诱发了细菌程序性死亡过程;(2)TUNEL染色显示HNP-1促进DNA断裂;Annexin V染色显示HNP-1诱导使膜结构发生了显著变化,主要是内膜外翻;扫描电镜结果显示细菌表面产生了大量凋亡样小泡。上述经典表型实验确认HNP-1诱发大肠杆菌细菌程序性死亡过程。3.HNP-1通过和RecA结合,抑制其活性:(1)采用Ni-NTAbeads富集带有His-tag的HNP-1及其相互作用蛋白,经质谱鉴定,结合蛋白功能注释,筛选得到可能和HNP-1相互作用的蛋白RecA;(2)Western blot验证在HNP-1富集的相互作用蛋白溶液中存在RecA表达;又用RecA蛋白抗体富集其相互作用蛋白,在其中同样鉴定到HNP-1,从而正向和反向都确认了两者具有相互作用;(3)随着诱导时间延长,mature HNP-1逐渐替代了 preproHNP1和RecA结合,进一步说明是mature HNP-1和RecA相互结合为主;(4)通过分子对接软件ZDOCK和PyMoL预测RecA和mature HNP-1的结合位点,发现mature HNP-1正好能结合在RecA发挥重组修复活性的位点Asp-161和Ser-162,使RecA不能和DNA结合,抑制其活性;(5)采用体外实验证实加入10 μM mature HNP-1可以显著降低RecA和ssDNA的结合水平,抑制RecA酶活性。通过本项研究,我们发现大肠杆菌不能高效表达全长HNP-1的原因是会激活产生有杀菌活性的mature HNP-1。并通过超滤法获得了纯化的有活性的mature HNP-1,为批量生产mature HNP-1提供了一种操作简单和成本低廉的技术方案。我们的研究还揭示了 mature HNP-1在细菌内的作用靶点RecA。Mature HNP-1可以抑制RecA蛋白和ssDNA结合,从而抑制其SOS修复功能。RecA由于其具有的重要功能,已经成为抗耐药菌治疗的理想靶点。鉴于HNP-1在抑制RecA活性中的重要作用,有望成为新型抗耐药菌药物。