【摘 要】
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目的:在体外通过悬浮红细胞上清与心肌细胞共培养来进行红细胞代谢物对心肌细胞的毒性作用评价,并对可能的毒性作用机制进行研究,以期为制定临床输血指南、降低输血风险、研制新型红细胞保存液提供新的基础研究依据。方法:（1）5人份2单位少白细胞悬浮红细胞,分别在库存0d、14d和35d时离心分离上清,与具有搏动特性的人多潜能干细胞定向分化得到的心肌细胞（human-induced pluripotent s
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目的:在体外通过悬浮红细胞上清与心肌细胞共培养来进行红细胞代谢物对心肌细胞的毒性作用评价,并对可能的毒性作用机制进行研究,以期为制定临床输血指南、降低输血风险、研制新型红细胞保存液提供新的基础研究依据。方法:（1）5人份2单位少白细胞悬浮红细胞,分别在库存0d、14d和35d时离心分离上清,与具有搏动特性的人多潜能干细胞定向分化得到的心肌细胞（human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPS-CMs）体外共培养（17%终浓度,模拟大量输血）,利用实时无标记的心肌细胞分析技术（real-time cellular analysis,RTCA）实时记录心肌细胞搏动状态,通过心肌细胞搏动状态分析评价不同保存期红细胞代谢物的毒性作用。（2）取保存0d、14d、35d的悬浮红细胞上清（supernatant of suspended red blood cells,SSRBCs）,通过生物化学方法测定上清中生化指标的水平改变,鉴定可能的毒性作用物质及浓度;应用基于TandemMassTags（TMT）标记技术的蛋白质组学分析方法对SSRBCs进行蛋白质组学分析,利用生物信息学分析技术探寻在疾病的发生、发展中具有重要作用的功能蛋白质。（3）①配置与0d、14d、35d SSRBCs中相应浓度的钾（potassium,K）、乳酸（lacticacid,LA）及二者混合的溶液,分别与hiPS-CMs细胞体外共培养（17%终浓度,模拟大量输血）,评价SSRBCs中K及LA对心肌细胞的毒性作用。②将35d SSRBCs、35d K及心肌细胞维持液分别与hiPS-CMs细胞体外共培养,作用48h后对hiPS-CMs细胞进行免疫荧光染色,观察细胞核、肌丝及肌节形态。③提取hiPS-CMs细胞RNA进行mRNA基因芯片检测,通过生物信息学分析技术,筛选与毒性作用相关的信号通路。结果:（1）Od SSRBCs对hiPS-CMs细胞搏动状态作用不明显;14d SSRBCs可使hiPS-CMs细胞停止搏动,48h时搏动状态可以恢复;35d SSRBCs可使hiPS-CMs细胞停止搏动,48h时搏动状态仍未恢复。（2）0d、14d、35d SSRBCs中K、Cl、LA、游离血红蛋白（Free Hemoglobin,FHb）水平持续升高,Na、pH值、Glu水平持续降低,K和LA水平变化最为明显;Od、14d、35dSSRBCs蛋白质组学分析共鉴定和定量了 1089种蛋白。Od和35d样本蛋白水平差异最明显,35d与Od比较,66蛋白水平升高,3蛋白水平降低（>1.5倍,P<0.05）。（3）①0d、14d钾溶液均对hiPS-CMs细胞搏动状态无明显影响;35d钾溶液使hiPS-CMs细胞停止搏动,第48h时能够恢复;钾和乳酸混合溶液对hiPS-CMs细胞搏动状态的影响同钾溶液一致;乳酸溶液对hiPS-CMs细胞搏动状态无明显影响。②35d SSRBCs处理24h,hiPS-CMs细胞发生明显皱缩,处理48h时皱缩更为明显;35dK处理24h,hiPS-CMs细胞皱缩不明显,处理48h时hiPS-CMs细胞发生明显皱缩。35d SSRBCs及35d K处理48h时,免疫荧光染色结果显示细胞肌丝肌节均未见明显断裂,细胞核未见明显形态改变。③基因芯片检测结果显示35d SSRBCs处理组和正常对照组相比hiPS-CMs细胞共有54个基因信号表达上调、86个基因信号表达下调（>2倍,P<0.05）;35dK组和正常对照组相比没有基因发生明显表达差异。根据GeneOntology（GO）富集分析及信号通路分析结果筛选出与心肌细胞搏动相关的15个差异表达基因,可能在35d SSRBCs的毒性作用中起到重要作用。结论:（1）在模拟大量输血条件下,保存期长悬浮红细胞代谢物对心肌细胞具有毒性作用,保存期越长毒性作用越明显。（2）钾在保存期长悬浮红细胞上清对心肌细胞的毒性作用中发挥了重要作用,但不是全部作用,钾离子之外的红细胞代谢物成分单独或协同发挥了心肌细胞毒性作用。（3）心肌细胞中与心肌细胞搏动相关的部分信号通路可能与毒性作用机制相关,但其具体机制尚需进一步研究。（4）保存时间长的红细胞大量输注可能是产生不良临床预后的危险因素,临床应用时应加以关注。
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