研究背景与非糖尿病患者相比,糖尿病患者的心血管发病率和死亡率的风险显著增高。糖尿病与血管闭塞后的不良预后相关,例如缺血性心脏病。血管生成对于心肌梗死(myocardial infarction,MI)之后重建对存活的心肌的血液供应是至关重要的,并且因此在心脏功能的恢复中起到重要作用。血管生成依赖于内皮的细胞增殖,迁移和小管生成。然而,糖尿病损伤血管生成的分子机制仍然很大程度上未知。所有真核生物细胞内液的pH值被称为细胞内pH(intracellularpH,pHi)值。pHi值的轻微变化,即使在生理范围内,也可能改变细胞功能。在哺乳动物的细胞中,pHi值由膜蛋白钠氢交换蛋白1(Na+/H+exchanger 1,NHE1)严格控制。NHE1通过交换细胞内H+和细胞外Na+以增加pHi值。在病理刺激下,NHE1被激活,在心脏重塑时导致细胞内碱化和细胞功能障碍。相比之下,我们和其他学者研究表明,细胞内酸中毒(intracellularacidosis,IA)通过抑制NHE1改善糖尿病时的内皮功能,并抑制血管肥厚和心肌病变,表明NHE1激活在糖尿病血管并发症的重要作用。然而,NHE1激活是否在糖尿病损伤血管生成中起重要作用尚未完全了解。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在血管内环境稳定和血管生成中调节细胞存活,增殖和代谢等多种基本功能。许多与血管内皮生长因子相关的血管生成功能是通过细胞内活化的Akt信号传导通路介导的。在内皮细胞中,与NHE1活化相似,Akt的失活也参与糖尿病时的内皮功能障碍。因此,我们假设Akt活性可能与pHi值相关,并且高血糖可能通过激活NHE1以诱导细胞内碱化,引起Akt失活。本研究旨在研究NHE1抑制或Akt激活在高糖(High Glucose,HG)损害内皮功能中的作用和机制,然后探索NHE1,Akt和NHE1选择性抑制剂cariporide在糖尿病小鼠心肌梗死后的血管生成和心功能恢复中的作用。研究目的:1.诱导HUVECs细胞内酸化模型并研究Akt是否被IA激活2.检测HG对HUVECs中NHE]活性和pHi值的影响3.研究抑制NHE1或过表达Akt能否逆转HG损伤HUVECs的迁移能力和小管形成能力4.研究NHE1和Akt对糖尿病小鼠MI后血管新生和心功能恢复的影响5.研究NHE1抑制剂cariporide对糖尿病小鼠MI后血管新生和心功能的影响研究方法1.细胞培养及细胞内酸化(IA)模型的建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)用内皮细胞培养基(ECM)进行培养。IA模型用NH4Cl溶液负载法进行诱导。首先,HUVECs用Tyrode缓冲液平衡90分钟,然后用30mM NH 4 Cl溶液培养5分钟。最后用含NHE]抑制剂cariporide的Tyrode缓冲液或不含Na+的Tyrode缓冲液代替NH4Cl溶液从而诱导IA模型。2.HUVECs 细胞转染 SiRNA转染NHESiRNA,研究NHE1对HUVECs小管形成和细胞迁移的影响。3.HUVECs细胞转染慢病毒以携带Akt cDNA的慢病毒构建lenti-Akt,慢病毒在含2%FCS的无抗生素培养基中转染过夜。Lenti-Akt转染的目的是研究其对内皮细胞小管形成和细胞迁移的影响。4.细胞内pH值的测定通过使用pH敏感性荧光染料BCECF在测量HUVECs中pHi值。5.细胞内NHE1活性测定在处理HUVEC后,通过使用测量 NH4Cl负载法诱导的IA后pHi恢复的初始速率来测定NHE1活性。6.体外小管形成实验将HUVECs接种在用生长因子减少的Matrigel胶包被的细胞培养皿上,使用含或不含HG的培养基(含有0.5%FCS)培养。24小时后,通过显微镜拍摄照片。7.细胞迁移实验应用划痕试验来检测细胞的迁移。在将细胞接种到24孔板中后,用灭菌的枪头在板底部的划十字。分别拍摄零点,一天,两天,三天,四天时划伤的交叉点,计算细胞迁移数,并计算迁移率。8.动物模型的建立将8-12周龄,20-25g的雄性野生型C57BL/6J小鼠饲养在温度控制的笼中,并给予自由取水和正常食物。连续5天腹腔注射小剂量STZ(50mg/kg/day)用于诱导胰岛细胞破坏和持续性高血糖。当 STZ注射2周后随机血糖水平大于300 mg/dl时认定为高血糖。通过结扎冠状动脉左前降支(LAD)建立小鼠心肌梗死模型。首先,用2%异氟烷麻醉小鼠。然后,在小鼠胸骨左缘第4肋间开胸,并轻轻地将心脏从胸腔中挤出.用6.0号无损伤线结扎冠状动脉左前降支(LAD)。9.超声心动图检测心脏功能MI手术后两周,小鼠左侧卧位进行标准的胸骨旁超声。通过超声心动图系统计算收缩或舒张的左心室内径(LVID或LVIDd),射血分数(EF)和缩短分数(FS)。10.组织学染色将心脏组织石蜡包埋,切片(5μm)染白色。HE染色用于检查梗死面积。免疫组织化学检查α-SMA,NHE1,Akt,pAkt 和 endomucin。11.蛋白印迹(Western blot)从不同组的细胞和心脏组织提取蛋白质。通过Westernblot检测pAkt,Akt,NHE1,PTEN,pGSK的表达水平。研究结果1.IA增加内皮细胞中的Akt磷酸化在NH4Cl负载法诱导的细胞内酸化模型中,Akt的磷酸化水平和活性明显增加。2.HUVECs中的pHi值决定Akt磷酸化水平将HUVECs细胞置于含nigericin的不同PH值的高K+-HBS缓冲液30min,此时pHi值等于细胞外pH(pHe)值。与7.2-7.4的pHi值相比,低pHi值(6.4-7.0)增加细胞内Akt的磷酸化。3.PI3K参与内皮细胞中IA诱导的Akt激活PI3K抑制剂wortmannin在pHi值为6.4时显著消除了细胞内Akt磷酸化的升高,但在pHi值为7.4时不改变细胞中Akt磷酸化的水平,说明PI3K-PDK1信号传导通路介导细胞内酸化诱导的Akt磷酸化4.HG刺激HUVECs可激活NHE1并抑制Akt磷酸化HG刺激1小时后,NHE1活性明显增加;而pHi值则在HG处理2小时后开始升高。但Akt磷酸化水平和活性在HG处理2小时后开始逐渐降低。5.HG经NHE1抑制Akt的磷酸化HG刺激后细胞经NHE1抑制剂cariporide处理后,Akt的磷酸化水平和活性并没有降低,表明HG诱导的Akt失活是通过活化NHE1实现的。NHE1siRNA而非Control siRNA阻断了高糖对Akt磷酸化的影响,进一步说明NHE1的活化在HG抑制Akt磷酸化中有着不可或缺的作用。6.HG通过NHE1激活和Akt抑制损伤HUVECs的小管形成能力HG刺激后,与NHE1 siRNA组相比,转染Control siRNA的HUVECs小管形成明显减少。Akt蛋白表达上调可促进HG干预后的小管形成。7.HG通过活化NHEI和抑制Akt损伤HUVECs的迁移能力HG可显著抑制转染Control siRNA或lenti-Vector慢病毒的HUVECs的迁移率,但对转染NHE1 siRNA或转染lenti-Akt慢病毒的HUVECs的迁移率无明显影响。8.高血糖通过激活NHE1或抑制Akt减少小鼠MI后的血管生成α-SMA和endomucin的免疫组织化学结果显示,NHE1缺失或Akt过表达的糖尿病小鼠梗死后心脏的毛细血管密度显著增加。9.NHE1缺失或Akt过表达促进糖尿病小鼠MI后心脏功能的恢复超声结果显示,NHE1缺失或Akt过表达改善糖尿病小鼠梗死后心脏功能。1O.Cariporide促进糖尿病小鼠MI后的血管生成并改善心脏功能α-SMA和endomucin免疫组织化学的结果显示,Cariporide增加了糖尿病小鼠缺血心脏中的毛细血管和小动脉密度,并且稳定地降低心肌梗死后糖尿病小鼠的 LVIDs 和 LVIDd,升高 FS 和 EF。研究结论1.IA增加内皮细胞中的Akt磷酸化;2.HG通过NHEI激活和Akt抑制损伤HUVECs的小管形成和迁移能力;3.NHE1缺失或Akt过表达促进糖尿病小鼠MI后血管生成和心脏功能的恢复;4.NHE1选择性抑制剂Cariporide 可促进糖尿病小鼠MI后的血管生成并改善心脏功能。研究背景洛伐他汀可通过抑制HMG-CoA还原酶活性从而抑制HMG-CoA转化为甲羟戊酸,因此被用来治疗高胆固醇血症。从胆固醇代谢过程来看,越来越多的证据表明,他汀类药物对心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)有潜在的益处。已有研究证明氧化应激可引起内皮细胞功能紊乱,而后者是包括动脉粥样硬化和高血压在内的心血管疾病的早期事件和标志。他汀类药物通过抑制血管细胞氧化应激而阻止内皮细胞功能紊乱的作用这一观点已被广泛接受。然而,他汀抑制CVD中氧化应激的作用靶点尚未完全阐明。一些先前的研究已证明CVD发生过程中,蛋白酶体激活与氧化应激以及随后发生的内皮细胞功能紊乱相关。在真核细胞中,蛋白酶体负责大多数目标蛋白的降解。蛋白酶体的功能受激动剂调节,激动剂以单链或双链的形式与20S核心催化亚基末端结合,并打开核心蛋白酶体的末端以使目标蛋白进入。作为蛋白酶体激动剂家族(proteasome activators,PAs)的一 员,PA200在哺乳动物组织中广泛表达,并在DNA损伤过程中起重要作用。MicroRNA(miRs)是一种长约20个核苷酸的单链小分子RNA,通过与目标mRNA部分互补,抑制mRNA的降解或翻译来调节基因表达。近日,AnnaS等学者报告,microRNA在蛋白酶体活性的调节过程中起重要作用。进一步研究表明,在骨髓瘤细胞中,miR-29b可通过作用于编码PA200蛋白的PSME4基因抑制蛋白酶体。现有数据表明,在成骨细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞中,他汀类药物如洛伐他汀可通过抑制蛋白酶体活性来发挥其作用。因此,确定他汀类药物在CVD中是否通过上调miR-29b抑制蛋白酶体活性是十分有意义的。在本实验中,我们研究洛伐他汀如何调节PA200,并确定miR-29b在蛋白酶体激活中的作用。我们建立大鼠糖尿病和血脂异常模型,研究洛伐他汀和miR-29b在氧化应激介导的内皮功能障碍中的作用机制。研究目的1.研究洛伐他汀对miR-29b表达的影响;2.研究洛伐他汀对蛋白酶体活性的影响及其机制;3.研究大鼠糖尿病和高血脂模型中,洛伐他汀和miR-29b在氧化应激介导的内皮功能障碍中的作用机制。研究方法1.细胞培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)用内皮细胞培养基(ECM)进行培养。2.慢病毒载体的构建和转染包含 scr-miR,anti-miR29b,pre-miR29b 和 PA200cDNA 的慢病毒由上海吉玛公司构建。慢病毒在含有2%FBS的无抗生素培养基中转染过夜。然后洗涤细胞并在新鲜培养基中再温育12小时后,进行实验。3.HUVECs 细胞转染 SiRNAHUVECs用PA200的siRNA转染以检查其对洛伐他汀抑制蛋白酶体活性的作用。4.蛋白酶体活性的检测通过用荧光酶标仪在380/460nm,37℃下检测游离的7-酰胺基-4-甲基香豆素,连续监测蛋白酶体活性。5.细胞和组织中ROS检测通过DHE荧光和高效液相色谱两种方法测定培养细胞中产生的ROS。将细胞与DHE(1OM)共培养30分钟,PBS冲洗后用甲醇提取,高效液相色谱法采用C-18列来分离和量化氧代乙啶和溴化乙锭。O2-的产量取决于DHE和氧代乙啶之间的转化。为了检测动脉原位的ROS产量,分离大鼠颈动脉并将其立刻进行冰冻切片,用10MDHE染色30分钟,冲洗后,用荧光显微镜观察。6.RNA定量使用基于Trizol的RNA分离方案提取总RNA。RNA通过Nanodrop定量。使用Superscript Ⅱ RT Kit对每个RNA样品进行cDNA合成,并使用Taqman PCR试剂进行实时定量聚合酶链反应。7.大鼠离体主动脉环制备通过静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)在麻醉下处死大鼠。立即开胸取出降主动脉,仔细分离血管周围结缔组织,将主动脉切成3-4毫米长的薄片。8.糖尿病和高血脂模型的建立对SD大鼠连续5天腹腔注射小剂量STZ(50 mg/kg/day),损伤胰岛细胞造成大鼠持续的高血糖,当血糖大于300 mg/dl时认定为糖尿病模型建立成功。用乙醚麻醉SD大鼠,自舌下静脉注射LDL溶液(4 mg/kg)建立大鼠高血脂模型。9.丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测量通过使用试剂盒推荐的方案测定主动脉组织或血清中MDA含量,SOD活性和GSH-Px活性。10.蛋白印迹(Western blot)从不同组的细胞和主动脉组织提取蛋白质。通过Westemblot检测PA200的表达水平。研究结果1.洛伐他汀上调内皮细胞中miR-29b表达内皮细胞中洛伐他汀对miR-29b的上调作用具有时间依赖性和剂量依赖性。2.洛伐他汀可降低内皮细胞中蛋白酶体活性通过特定浓度的洛伐他汀作用内皮细胞一定时间,我们确定了洛伐他汀在体外对蛋白酶体活性的下调作用。3.miR-29b调控洛伐他汀抑制内皮细胞蛋白酶体的活性在scr-miR组,洛伐他汀明显降低蛋白酶体活性,但是在anti-miR-29b组则无该现象。在miR-29b过表达组,洛伐他汀对蛋白酶体活性的抑制作用进一步增强。4.PA200是洛伐他汀处理的内皮细胞中miR-29b的作用靶点在转染scr-miR慢病毒的内皮细胞中,洛伐他汀显著降低PA200蛋白水平。然而,转染anti-miR-29b慢病毒组,洛伐他汀对PA200的下调作用消失;但pre-miR-29b慢病毒组,该作用显著增强。5.洛伐他汀对蛋白酶体的活性抑制是PA200依赖性的在空白载体组,洛伐他汀显著降低蛋白酶体活性;但是在PA200过表达组,该抑制作用消失。沉默PA200可消除洛伐他汀对蛋白酶体的抑制作用。6.阻断miR-29b可消除洛伐他汀抑制高糖等多种心血管危险因素诱导的ROS生成通过检测内皮细胞内DHE荧光密度,发现包括ox-LDL、H2O-2、TNF-α和HG在内的多种心血管危险因素显著增加细胞内活性氧产物,而洛伐他汀可消除这些异常现象。在转染scr-miR慢病毒的细胞内,洛伐他汀降低ox-LDL和HG诱导的活性氧产物,并且这些抑制作用在转染anti-miR-29b慢病毒的细胞中消失。7.洛伐他汀在离体大鼠降主动脉环中减轻多种氧化剂诱导的内皮功能障碍通过用ox-LDL的主要代谢产物LPC、外生自由基DPPH、内源性活性氧H2O2与大鼠主动脉环孵育,发现这些氧化剂都损害乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张。若用洛伐他汀预先处理主动脉环,则可消除这些氧化剂引起的损害。8.洛伐他汀在体内和体外均可改善HG引起的内皮功能损害HG降低离体鼠主动脉环的乙酰胆碱依赖性血管舒张,而高渗刺激则无此作用。洛伐他汀处理使HG对血管舒张的抑制作用减弱,且该作用具有剂量依赖性。在注射STZ构建1型糖尿病大鼠模型中,高血糖引起的内皮功能损害可被洛伐他汀改善,且具有剂量依赖性。此外,经洛伐他汀干预后,糖尿病大鼠血液中升高的MDA水平、降低的SOD活性和GSH-Px都可恢复。9.洛伐他汀改善高血脂大鼠的内皮功能损害在LDL注射前,分别用2mg/kg/d和4 mg/kg/d洛伐他汀预处理大鼠,可逆转LDL引起的大鼠内皮功能损害。此外,LDL引起的氧化应激,如SOD活性降低、血清MDA水平增加也被洛伐他汀治疗逆转。10.洛伐他汀减少糖尿病和高血脂模型大鼠体内活性氧产物心血管疾病危险因素包括糖尿病和高血脂血症,都显著增加大鼠颈动脉的活性氧产物,洛伐他汀治疗后可消除大鼠体内的这些异常。研究结论1.洛伐他汀在内皮细胞中可上调miR-29b表达和降低蛋白酶体活性;2.PA200是洛伐他汀处理的内皮细胞中miR-29b的作用靶点;3.洛伐他汀通过抑制氧化应激反应预防糖尿病和高血脂血症模型的大鼠内皮功能障碍