黄酮类化合物广泛存在于自然界,是一种重要的植物次级代谢产物。大部分黄酮类化合物在植物体中以苷的形式存在。糖基化是黄酮类化合物生物合成过程中常见的后修饰反应,它可以提高化合物的生物活性、稳定性、水溶性等。植物体内黄酮类化合物的糖基化一般由糖基转移酶催化实现,它们将糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体上从而衍生出各种各样的黄酮糖苷类化合物。黄酮糖苷类化合物在医药保健以及食品中具有重要的价值。近年来,随着代谢工程以及合成生物学技术的迅速发展,通过模式微生物进行代谢改造,合成植物源黄酮糖苷已取得一定的进展。但是关于黄酮醇7-O-葡萄糖苷(山柰酚7-O-葡萄糖苷和槲皮素7-O-葡萄糖苷)的生物合成研究报道较少,而且生物合成黄酮7-O-葡萄糖苷(芹菜素7-O-葡萄糖苷和木樨草素7-O-葡萄糖苷)的产量相对较低,很大程度上制约了对此类黄酮7-O葡萄糖苷的开发与应用。因此,通过筛选具有7-O糖基化功能的黄酮糖基转移酶(UGTs),阐明其催化活性,突出其催化优势实现以生物合成学技术制备天然黄酮糖苷产物具有重要的意义。已研究的糖基转移酶多数来源于维管植物,而苔藓植物中的糖基转移酶目前尚没有研究。苔类植物钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatu)m和地钱(Marchantiapolymorpha)属于早期陆生植物,在水生到陆生的进化过程中,为了适应复杂多变的陆地环境,其体内合成多样的次级代谢产物(包括黄酮类化合物、联苄类化合物、木脂素类化合物、萜类化合物以及香豆素类化合物等)。近年来我们已经克隆鉴定了钝鳞紫背苔和地钱中类黄酮生物合成途径上的几个关键酶,但是对这两种苔类植物中催化生成黄酮糖苷的糖基转移酶(GTs)的研究尚未报道。本实验从钝鳞紫背苔和地钱中克隆鉴定了黄酮类化合物糖基转移酶基因,对其进行功能鉴定、酶学特征分析以及合成生物学等研究。1.钝鳞紫背苔P.appendiculatum中多功能糖基转移酶基因的克隆与功能鉴定通过分析钝鳞紫背苔的转录组数据库,根据基因功能注释,从中找到了 4个注释为flavonoid:UDP-glycosyltransferase的候选基因,并分别命名为PaUGTl、PaUGT2、PaUGT3和PaUGT4。经序列比对发现,PaUGTs与来自其他植物中的UGTs相似度较低。但是其C端具有催化植物次生代谢产物糖基化的UGTs所特有的保守 PSPG(Plant Secondary Product Glycosyltransferase)序列。对 PaUGTs进行进化树分析和功能预测,结果显示:PaUGTs属于类黄酮7-O-糖基转移酶进化树分支。体外酶活结果表明PaUGT1和PaUGT2具有广谱的底物催化活性,都可以催化黄酮和黄烷酮类化合物的7-O糖基化,对于黄酮醇类化合物,PaUGT1主要催化其7-O糖基化,而PaUGT2催化其3-O糖基化。酶活动力学分析表明,PaUGT1和PaUGT2对黄酮醇类化合物的催化活性相当,但PaUGT1对黄酮类化合物的催化活性明显高于PaUGT2,可以作为生物合成黄酮类7-O葡萄糖苷的候选基因。这也是首次从苔类植物中鉴定出黄酮糖基转移酶基因。2.PaUGT1在类黄酮7-O-葡萄糖苷合成生物学中的应用以来自葡萄中的VvGT1晶体结构作为模板,通过同源模拟和分子对接技术得到PaUGT1与底物互作的蛋白模型,通过定点突变获得一个突变蛋白PaUGT1-Q19A,其对黄酮类、黄酮醇类化合物的催化活性高于PaUGT1。通过在大肠杆菌中表达PaUGT1-Q19A,首次生物合成得到转化率大于70%的黄酮醇7-O-葡萄糖苷。将来源于同一植物的上游基因黄酮合酶PaFNS I-1与PaUGT1-Q19A共表达可以明显提高黄酮糖苷的产量。此外,通过将UDP-glucose过表达载体与共表达PaFNS I-1和PaUGTl-Q19A载体一起构建到大肠杆菌BL21中,通过饲喂条件优化,最终可以得到35.0 mg/L(81.0 μM)芹菜素7-O-葡萄糖苷和39.6 mg/L(88.6 μM)木樨草素7-O-葡萄糖苷。该研究为黄酮7-O-葡萄糖苷的生物合成研究提供了候选基因和策略。3.地钱M polymorpha中糖基转移酶的发掘与体内外功能鉴定基于另一个苔类植物地钱的基因组数据,根据基因功能注释并结合序列分析,从地钱中筛选得到18个可能的UGT基因,并对其中的MpUGT1和MpUGT2进行深入的功能研究。进化树分析显示这两个基因属于类黄酮3-O-糖基转移酶进化分支。将这两个基因从地钱中克隆出来,构建入大肠杆菌原核表达载体,体外酶活结果表明MpUGT1和MpUGT2是黄酮醇3位糖基转移酶。构建了植物过表达载体pGWB5-MpUGT1和pGWB5-MpUGT2,并对其进行拟南芥的遗传转化。通过对转基因和野生型拟南芥黄酮醇糖苷的分析,鉴定MpUGTs在植物体内的糖基转移酶功能。