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作为肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞之一,巨噬细胞与肿瘤细胞之间的信息交流,已然成为肿瘤基础研究领域关注的焦点。然而,肿瘤相关性巨噬细胞源性外泌体对乳腺癌细胞影响的探索研究却并不多见。为此,本课题以肿瘤相关性巨噬细胞-外泌体-乳腺癌细胞生物学行为调控为靶向,探索肿瘤相关性巨噬细胞及其来源外泌体对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。课题研究不仅可以丰富对外泌体作为细胞通讯交流载体及其在肿瘤微环境塑造中重要作用的认识,也为筛选相关分子靶标应用于临床肿瘤患者的早期诊断、药效评价、预后判断奠定理论基础。目的分析肿瘤相关性巨噬细胞及其来源外泌体对乳腺癌细胞生物学行为的影响;生物信息学分析肿瘤相关巨噬细胞外泌体对乳腺癌细胞生物学行为影响的机制。方法1、选择乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）培养上清液作用于佛波酯活化的THP-1细胞48h,获得肿瘤相关性巨噬细胞;流式细胞术检测肿瘤相关性巨噬细胞标志物CD68和CD206的表达;CCK-8法、细胞划痕、Transwell、流式细胞术等实验方法检测肿瘤相关性巨噬细胞培养上清液对乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响。2、超速离心法提取肿瘤相关性巨噬细胞外泌体;免疫印迹（Western blotting）、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）等方法对外泌体标志物、形态以及颗粒直径进行测定;PKH67标记肿瘤相关性巨噬细胞外泌体,倒置荧光显微镜观察乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）对外泌体的摄取;CCK-8法、细胞划痕、Transwell、流式细胞术等实验方法检测肿瘤相关性巨噬细胞外泌体对乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响;应用外泌体释放抑制剂（GW4869）验证肿瘤相关性巨噬细胞外泌体对乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）生物学行为的影响。3、高通量测序检测肿瘤相关性巨噬细胞外泌体作用的乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）与对照组中m RNA的表达;GSEA分析乳腺癌细胞株中的富集通路;使用R语言筛选两个乳腺癌细胞株中的共差异表达基因;TCGA乳腺癌临床标本数据库中下载乳腺癌与癌旁m RNA与mi RNA表达数据;R语言展示共差异表达基因在乳腺癌临床标本癌与癌旁中的m RNA表达差异;K-M Plotter数据库针对共差异表达基因进行生存分析并绘制生存分析曲线;q-PCR进一步验证并筛选共差异表达基因;Target Scan和mi RWalk数据库筛选共差异表达基因上游调控mi RNA;R语言计算TCGA乳腺癌标本m RNA与mi RNA相关性。结果1、流式细胞术显示,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞CD68、CD206双阳性细胞数明显增加（P＜0.01）;CCK-8方法检测显示,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞对乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）增殖无明显影响;细胞划痕、Transwell迁移与侵袭实验表明,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞能够促进乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）的迁移和侵袭（P＜0.01）;流式细胞术显示,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞能够抑制乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）的凋亡（P＜0.05）。2、超速离心法提取肿瘤相关型巨噬细胞外泌体后,免疫印迹检测显示,肿瘤相关性巨噬细胞外泌体中存在CD63和TSG101的表达;透射电镜、纳米颗粒跟踪分析显示,肿瘤相关性巨噬细胞外泌体呈现盘状、双分子层膜结构,且颗粒直径大多分布在140～160nm之间;外泌体荧光标记摄取实验显示,PKH67标记的肿瘤相关性巨噬细胞外泌体明显能够被乳腺癌细胞摄取并分布于细胞质中;CCK-8方法检测显示,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞外泌体对乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）的增殖无明显影响;细胞划痕、Transwell迁移与侵袭实验表明,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞外泌体能够明显促进乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）的迁移和侵袭（P＜0.01）,而且该效应能被外泌体抑制剂（GW4869）逆转（P＜0.01）;流式细胞术显示,与对照组相比,肿瘤相关性巨噬细胞外泌体对乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB-231）的凋亡无明显影响。3、高通量测序结果显示,原始数据结果Clean ratio均高达96%以上,与人类基因组匹配率高达98%以上,对照组与实验组样品基本分离;与对照组相比,BT549细胞株实验组中上调基因347个,下调基因222个;MDA-MB-231细胞实验组中上调基因173个,下调基因157个;GSEA分析两株乳腺癌共富集标志物为干扰素-α应答和干扰素-γ应答标志物;在两株乳腺癌细胞株中共有10个共差异表达基因,其中2个为非蛋白编码基因,PCDHGA1、CDK2AP1、PROSER1、ITGβ4、SLC25A28、WDR6、DUSP19以及GMFB等8个为蛋白编码基因;TCGA数据库信息显示,除WDR6外,其余7个共差异基因在乳腺癌与癌旁组织中均存在明显表达差异（P＜0.05）;K-M Plotter数据库分析显示,8个共差异表达基因的表达与乳腺癌患者生存率均存在明显相关性（P＜0.01）;q-PCR结果显示:BT549细胞中PCDHGA1、ITGβ4、GMFB有明显表达差异;MDA-MB-231细胞中ITGβ4、GMFB、SLC25A28有明显表达差异。综合以上数据分析结果,并结合Target Scan和mi RWalk数据库信息,筛选出2个在TCGA分析、患者生存分析和q-PCR存在一致的共差异表达基因及其可能的上游调控负相关mi RNA分子,包括ITGβ4/mi R-190b、GMFB/mi R-660。结论1、乳腺癌细胞诱导的肿瘤相关性巨噬细胞呈现M2极化表型。2、肿瘤相关性巨噬细胞可促进乳腺癌细胞BT549与MDA-MB-231的迁移、侵袭并抑制其凋亡。3、肿瘤相关性巨噬细胞外泌体可促进乳腺癌细胞BT549与MDA-MB-231的迁移与侵袭。4、高通量测序、生物信息学分析和q-PCR验证筛选结果显示:肿瘤相关性巨噬细胞对乳腺癌细胞迁移、侵袭的促进作用与ITGβ4和GMFB等基因的表达失调密切相关。