烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD-+)是生命体内重要的辅酶,在氧化还原、基因表达、能量代谢、调控细胞生命周期和疾病等生命过程中具有重要的作用。NAD+的合成方法分为化学和生物两类,与化学法相比,用生物催化法制备NAD+具有工艺条件简单、绿色环保、耗时短等优点。本文利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)和烟酰胺核糖苷激酶(NRK)作为生物催化剂,建立NAD+的催化反应体系,NRK可催化NR和ATP反应得到NMN,NMNAT可继续催化NMN和ATP反应得到NAD+。利用生物信息学方法,从NCBI数据库中筛选出了 5种NMNAT编码基因,从中鉴定出了能够在大肠杆菌中高效表达出具有催化活性的目的基因N-cva,从而获得了一种可用于NAD+制备的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶。探究了工程菌N-cva的最佳发酵条件,确定了 N-cva的最佳发酵条件为:在LB培养基OD600=0.7时,加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG,诱导温度为32℃,诱导时长为6h。在5L发酵罐中进行高密度发酵试验,最终得到湿菌体约180g。探索了工程菌N-cva的酶学性质,发现其具有较好的热稳定性,在90℃高温环境下能保留最适反应温度条件下约80%的活性,在70℃条件处理1h,仍保留约60%的活性,在中性和偏碱条件下的活性高于酸性条件。对N-cva的催化工艺进行了研究,确定最佳反应条件为:反应温度40-50℃,反应pH=7.0,反应缓冲液为50mM咪唑-磷酸缓冲液,酶底比为1.3:1。按照最佳反应条件设置催化反应,NAD+产率可达92%以上。在大肠杆菌中高效表达了 NRK,确定了 NRK的最佳发酵条件:在LB培养基OD600=0.7时,加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG,诱导温度为28℃,诱导时长为12h。探究了 NRK的催化工艺,最佳的催化工艺条件为:反应温度为40℃,反应pH=5.0,反应酶底比为0.8:1。根据优化后的反应条件设置催化反应,产率可达90%以上。构建了 NRK和N-cva在同一体系中催化NR和ATP反应生成NAD+的反应工艺,NRK和N-cva在各自的最佳反应条件下催化反应,最终产率可达80%。