肝纤维化是各种不同致病因子引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共有病理改变,是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应,其共同特点是以胶原为主的细胞外间质（extracellular matrix, ECM）的过度沉积。活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）是肝脏产生过度胶原的主要细胞。在各种促纤维生成因素的作用下,HSC从静止状态转变为活化状态即产生胶原的肌成纤维样细胞。交感神经系统（sympathetic nervous system, SNS）是肝内神经的重要组成部分,参与肝脏功能、新陈代谢等方面的调控。近年来越来越多的研究显示,交感神经系统可通过对HSC增殖和凋亡等细胞行为的调控,影响肝纤维化的发生发展。卡维地洛是一种具有多种作用的交感神经肾上腺素能受体阻滞剂包括非选择性的β阻滞和α1阻滞,并且是一种强的抗氧化物和强的反应性的氧自由基清除剂。研究发现卡维地洛可通过其交感神经受体阻滞作用直接抑制心脏成纤维细胞的增殖,进而阻止细胞外间质的合成,以达到减轻心脏间质重塑,预防心力衰竭发生发展的作用。然而,其在肝纤维化中的作用,尤其是对肝纤维化过程中的胶原代谢及氧化应激的影响,目前国内外少有报道。我们前期的研究已显示卡维地洛可以抑制肝纤维化大鼠肝组织的HSC活化增殖,促进活化HSC凋亡。本研究将进一步研究该药对肝纤维化病理过程中肝组织Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原代谢的调控作用及氧化应激的影响。目的:观察肾上腺素能受体阻滞剂卡维地洛对胆汁淤积性大鼠纤维化肝组织中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原代谢及氧化应激的影响。方法:采用胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型,并给予卡维地洛进行药物干预,将50只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术对照组、模型组、小剂量卡维地洛组(0.1 mg·kg^-1·d^-1)、中等剂量卡维地洛组(1 mg·kg^-1·d^-1)和大剂量卡维地洛组(10mg·kg^-1·d^-1),共5组,每组10只。各组又随机分成两小组,分别在术后2 wk、4 wk留取肝组织。应用HE、Masson染色了解肝脏病理组织学变化及纤维化程度;分别应用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法（TBA）检测肝组织SOD活性和MDA水平,以了解肝组织氧化应激状态;应用免疫组织化学法对肝组织Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及TGF-β1含量及分布进行检测;应用Western Blot及Real time Q-PCR检测肝组织MMP-2及TIMP-2在肝纤维化过程中的动态表达。结果:1术后大鼠一般情况观察大鼠胆总管结扎后1 h～2 h恢复活动,48 h左右尿液变黄,3～4天后皮肤毛发开始转黄,精神逐渐变差,进食量少于对照组,体重增加不明显或稍有下降。8～9天后逐渐出现嗜睡,反应迟钝,活动减少,黄疸明显,鼠粪呈灰白色。20天后进食量明显减少,体重与对照组相比明显降低,并且部分大鼠逐渐出现腹部隆起。2胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型成功建立模型大鼠肝脏肉眼观呈褐绿色或棕色,表面略呈细颗粒状,质地变硬,造模4 wk组共3只大鼠有腹水产生。HE及Masson三色染色显示,假手术对照组肝小叶结构完整,肝板排列整齐,肝细胞无肿胀,无胆管增生,无淤胆及淋巴细胞浸润,核仁清晰,少量结缔组织局限于门管区。造模2 wk,模型组肝板正常排列消失,小叶结构紊乱,门管区小胆管广泛增生,并向小叶内延伸、肝小叶呈花环状;新生小胆管周围纤维组织增生,门管区面积扩大,肝小叶内亦有纤维组织增生。造模4 wk,模型组肝脏广泛纤维结缔组织增生,增生的纤维间隔互相连接、包绕、分割,改建原来的肝小叶甚至形成假小叶。3卡维地洛对肝脏病理组织学的影响HE染色显示,造模2 wk,卡维地洛各剂量组较模型组纤维组织及小胆管增生减少,肝索迂曲及肝小叶结构破坏较轻;造模4 wk,卡维地洛各剂量组仍有肝小叶正常结构部分破坏,但小叶周边及汇管区纤维组织增生较轻,肝索紊乱较模型组轻,并可见肝细胞再生现象。Masson三色染色显示,造模2 wk,模型组和小、中、大剂量给药组胶原面积密度均显著高于假手术对照组,P<0.01;小剂量给药组与模型组相比无明显差异,P>0.05;中、大剂量给药组与模型组相比有明显降低,P<0.05、P<0.01;中、大剂量给药组与小剂量组相比也有明显降低,P<0.05、P<0.01;中、大剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。造模4 wk,模型组和小、中、大剂量给药组胶原面积密度均显著高于假手术对照组,P<0.01;小、中、大剂量给药组均与模型组相比也均有明显降低,P<0.05、P<0.01、P<0.01;大剂量给药组明显低于小、中剂量组,P<0.01、P<0.05;而小、中剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。4卡维地洛下调大鼠纤维化肝组织的胶原表达4.1卡维地洛降低2周Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原的表达免疫组织化学染色显示,造模2 wk,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ⅰ型胶原阳性面积密度（15.99%±1.47%, 12.66%±1.89%,11.24%±0.60%,10.58%±3.74%）均显著高于假手术对照组（3.05%±1.02%）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比明显降低,P<0.05,P<0.05,P<0.01;各给药组之间差异无显著性,P>0.05。模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ⅲ型胶原阳性面积密度（17.85%±1.92%,14.14%±0.64%,11.96%±2.01%,10.27%±0.99%）与假手术对照组（5.18%±0.79%）相比均显著增高,P<0.01;而小、中、大剂量给药组与模型组相比显著降低,P<0.01;大剂量给药组明显低于小剂量给药组,P<0.01,但小剂量组与中剂量组,中剂量组与大剂量组之间无显著差异,P>0.05。模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ⅳ型胶原阳性面积密度（11.89%±1.45%,9.30%±1.01%,9.14%±1.48%,8.80%±1.21%）比假手术对照组（1.82%±0.77%）显著增高,P<0.01;且小、中、大剂量给药组较模型组均明显降低,P<0.05;而小、中、大剂量给药组之间差异无显著性,P>0.05。4.2卡维地洛降低4周Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原的表达免疫组织化学染色显示,造模4 wk,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ⅰ型胶原阳性面积密度（23.69%±2.95%,15.74%±0.51%,14.57%±1.55%,12.54%±3.64%）均显著高于假手术对照组（4.14%±0.98%）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比明显降低,P<0.01;而小、中、大剂量给药组之间差异无显著性,P>0.05。模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ⅲ型胶原阳性面积密度（21.53%±0.76% ,16.84%±1.99%,16.03%±0.42%,11.17%±2.30%）较假手术对照组（5.48%±0.79%）均显著增高,P<0.01;小、中、大剂量给药组均低于模型组,P<0.01;且大剂量给药组显著低于小、中剂量给药组,P<0.01;但小与中剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。模型组和小、中、大剂量给药组肝组织Ⅳ型胶原阳性面积密度（18.05%±1.15% , 12.02%±1.50% ,11.41%±1.65%,9.84%±2.08%）比假手术对照组（2.01%±0.49%）均显著增高,P<0.01;而小、中、大剂量给药组与模型组相比明显降低,P<0.01;小、中、大剂量给药组之间差异无显著性,P>0.05。5卡维地洛对肝组织MMP-2蛋白及mRNA表达的影响Western Blot分析显示,造模2 wk,模型组和小、中剂量给药组肝组织MMP-2蛋白相对表达量（1.99±0.13,1.87±0.12,1.88±0.04）显著高于假手术对照组（1.24±0.09）,P<0. 01;而大剂量给药组（1.33±0.04）与假手术对照组之间无明显差异,P>0.05;大剂量给药组明显低于模型组、小、中剂量给药组, P <0.01,而小、中剂量给药组及模型组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk,模型组MMP-2蛋白相对表达量（1.49±0.22）明显较2周时降低;小、中、大剂量给药组MMP-2蛋白相对表达量（1.74±0.17,1.99±0.16,2.15±0.24）均高于假手术组（1.26±0.13）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均明显升高,P<0.01;大剂量给药组明显高于小剂量给药组,P<0.01;而模型组与假手术对照组、小剂量给药组与模型组、小剂量给药组与中剂量给药组以及中剂量给药组与大剂量给药组之间无显著性差异,P>0.05。应用Real time Q-PCR检测大鼠肝组织MMP-2 mRNA表达。结果显示,造模2 wk,以假手术对照组表达量为1,则模型组及小、中、大剂量给药组肝组织MMP-2 mRNA相对假手术对照组的表达量为1.83,1.58,1.53及1.12;模型组及小、中剂量给药组显著高于假手术对照组,P<0.01;大剂量给药组较模型组及小、中剂量给药组明显降低,P<0.05,而小剂量给药组与中剂量给药组,大剂量给药组与假手术对照组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk,以假手术对照组表达量为1,模型组MMP-2 mRNA相对表达量1.28明显较2周时降低;小、中、大剂量给药组MMP-2 mRNA相对假手术对照组的表达量为1.66、1.92、1.98均高于假手术组,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比均明显升高,P<0.01;而模型组与假手术对照组,小剂量给药组及中剂量给药组与模型组,小剂量给药组与中剂量给药组以及中剂量给药组与大剂量给药组之间无显著性差异,P>0.05。6卡维地洛下调大鼠纤维化肝组织TIMP-2蛋白及mRNA表达Western Blot分析显示,造模2 wk,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织TIMP-2蛋白相对表达量（1.41±0.09,1.32±0.05,1.27±0.23,0.78±0.06）均显著高于假手术对照组（0.53±0.05）,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05;大剂量给药组较模型组明显降低,P<0.01。大剂量给药组也明显低于小、中剂量给药组,P <0.01;而小、中剂量给药组与模型组,小、中剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。造模4 wk,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织TIMP-2蛋白相对表达量（1.42±0.07,1.12±0.13,1.06±0.15,0.92±0.07）显著高于假手术对照组（0.56±0.09）,P<0.01;小、中、大剂量给药组与模型组相比明显降低,P<0.01;大剂量给药组明显低于小剂量给药组,P <0.05;而小、中剂量给药组之间以及中、大剂量给药组之间相比无明显差异,P>0.05。应用Real time Q-PCR检测大鼠肝组织TIMP-2mRNA表达。结果显示,造模2 wk,以假手术对照组表达量为1,则模型组及小、中、大剂量给药组肝组织TIMP-2 mRNA相对假手术对照组的表达量为2.73,2.56,2.38及1.70;模型组及小、中、大剂量给药组显著高于假手术对照组,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05;大剂量给药组较模型组及小、中剂量给药组明显降低,P<0.01,P<0.05,P<0.05;而小、中剂量给药组与模型组之间比较无明显差异,P>0.05。造模4 wk,以假手术对照组表达量为1,则模型组及小、中、大剂量给药组肝组织TIMP-2 mRNA相对假手术对照组的表达量为2.67,1.97,1.89及1.54;模型组及小、中、大剂量给药组显著高于假手术对照组,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05;小、中、大剂量给药组较模型组均明显降低,P<0.05,P<0.01,P<0.01;而小、中、大剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。7卡维地洛降低肝组织中TGF-β1表达免疫组织化学结果显示:造模2 wk,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织TGF-β1阳性面积密度（10.10%±1.14%,9.51%±1.07%,7.14%±1.60%,6.44%±3.64%）均显著高于假手术对照组（4.14%±0.82%）,P<0.01;中、大剂量给药组与模型组相比明显降低,P<0.01;且中、大剂量给药组明显低于小剂量给药组,P<0.05;而小剂量给药组与模型组,以及中剂量与大剂量给药组之间差异无显著性,P>0.05。造模4 wk,模型组和小、中、大剂量给药组肝组织TGF-β1阳性面积密度（14.00%±1.81%,7.35%±0.68%,7.04%±0.33%,6.53%±0.81%）较假手术对照组（4.64%±0.34%）均显著增高,P<0.01, P<0.01, P<0.05, P<0.05;而小、中、大剂量给药组与模型组相比亦显著降低,P<0.01;但小、中、大剂量给药组之间差异无显著性,P>0.05。8卡维地洛对大鼠纤维化肝组织氧化应激的影响8.1卡维地洛降低大鼠纤维化肝组织中MDA（nmol/mg）含量硫代巴比妥酸法检测显示,造模2 wk,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织MDA含量（0.94±0.19,0.73±0.09,0.67±0.62,0.63±0.09）均显著高于假手术对照组（0.41±0.06）,P<0.01;小、中、大剂量给药组MDA含量较模型组均明显降低,P<0.01;而小、中、大剂量给药组之间相比无显著性差异,P>0.05。造模4 wk,模型组和小、中、大剂量给药组MDA含量（1.21±0.23,0.98±0.13,1.00±0.03,1.10±0.14）均高于假手术组（0.43±0.07）,P<0.01;小、中、大剂量给药组及模型组之间比较差异无显著性,P>0.05。8.2卡维地洛增加大鼠纤维化肝组织中SOD（U/mgprot）活性黄嘌呤氧化酶法检测显示,造模2 wk,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织SOD的值（1.48±0.14,1.73±0.13,1.78±0.11,1.84±0.16）均显著低于假手术对照组（2.24±0.11）,P<0.01。小、中、大剂量给药组与模型组相比显著增高,P<0.01;小、中、大剂量给药组之间无明显差异,P>0.05。造模4 wk,模型组和小、中、大剂量给药组大鼠肝组织SOD的值（0.84±0.06,1.50±0.10,1.66±0.14,1.67±0.19）均显著低于假手术对照组（2.32±0.14）,P<0.01。小、中、大剂量给药组与模型组相比显著增高,P<0.01;而小、中、大剂量给药组之间无显著性差异,P>0.05。结论:1卡维地洛可以下调纤维化肝组织中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白表达,这种作用尤以大剂量组最为显著。2卡维地洛在基因及蛋白水平下调肝纤维化早期MMP-2表达,上调肝纤维化晚期MMP-2表达,并持续下调TIMP-2 mRNA及蛋白表达,促进MMP-2/TIMP-2平衡的恢复;下调大鼠纤维化肝组织中TGF-β1的表达。这可能是卡维地洛下调肝纤维化组织中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原表达,减缓肝纤维化进程的机制之一。3卡维地洛可通过降低大鼠纤维化肝组织中MDA的含量、增高SOD的活性,从而起到拮抗肝纤维化过程中氧化应激损伤的作用。