背景:基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）是一种具有高度传染性,能够快速传播的蚊媒病毒,属于二类病原体。目前尚无获批上市的针对CHIKV的疫苗或药物。因此,开发针对这种病毒的控制和预防新举措就显得尤为迫切。然而,由于CHIKV的操作只能在Biosafety Level-3（BSL-3）及以上防护等级的实验室中进行,这极大地阻碍了CHIKV相关研究的进展。本文基于这一问题,制备了一种能够在Biosafety Level-2（BSL-2）实验室操作及应用的CHIKV假病毒,降低高致病性真病毒对实验环境的局限要求,促进对CHIKV更广泛的研究。方法:本研究以HIV-1慢病毒载体系统为基础,利用实验室前期获得的CHIKV基因,构建含有双报告基因和表达CHIKV包膜蛋白的假病毒,并将其应用到中和抗体的检测当中。整个研究主要分为以下四个部分:第一部分,构建CHIKV假病毒包装系统,对该系统中的一系列包装条件进行优化;第二部分,对优化后得到的病毒粒子进行超离浓缩,并对浓缩后得到的病毒粒子进行免疫印迹检测及电镜观察;第三部分,以该CHIKV假病毒为基础,建立96孔板微中和抗体检测系统,并对该系统中的一系列参数进行优化;第四部分,以所建立的CHIKV假病毒微中和抗体检测系统为基础,对CHIKV灭活病毒免疫兔血清、临床CHIKV康复患者血清进行中和效价检测。结果:首先,我们将CHIKV包膜蛋白基因插入真核表达载体中,利用慢病毒包装系统进行CHIKV假病毒的构建,并对系统中影响病毒滴度的各种包装条件进行优化,最终确定的包装条件为:CHIKV病毒毒株选择1151D4f,去除Capsid表达基因,使用转移质粒pLVX-IRES-ZsGreen1-Luc,以及转染试剂Lipo3000,以质粒摩尔比例1:1:1的条件进行转染,得到的假病毒滴度为1.61×105 TU/ml。然后,利用第一步成功构建的CHIKV假病毒,建立了假病毒微中和抗体检测系统,并对各种检测参数进行优化,最终确定的中和实验检测参数为:HEK-293T细胞50000个/孔,病毒接种量为500 TU/孔,于感染后96 h检测发光信号强度并计算中和抗体效价,能够得到最准确、最稳定的实验结果。接下来,利用上一步建立的CHIKV假病毒微中和抗体检测系统,对CHIKV灭活病毒免疫兔血清进行中和效价检测,通过与VSV-G假病毒中和实验结果进行对比,证明本研究所构建的CHIKV假病毒在中和抗体检测中具有良好的特异性。最后,我们也利用建立的CHIKV假病毒微中和抗体检测系统,对临床CHIKV康复患者血清进行了中和效价检测,并将检测结果与ELISA检测结果进行了对比,发现二者具有良好的相关性与一致性。由此可见,本研究所建立的CHIKV假病毒微中和抗体检测系统,具有良好的可靠性与灵敏度,可以替代传统的中和实验对血清等样品进行中和效价检测,且操作更加方便,结果更加客观。结论:本研究成功构建了双报告基因CHIKV假病毒,并基于该假病毒建立了安全、可靠的微中和抗体检测系统,为在BSL-2实验室中,开展CHIKV相关研究,例如抗病毒药物筛选、单克隆抗体筛选、疫苗评价等提供了有效的手段。