前言：　　 瞬时感受器电位(transientreceptorpotential,TRP)是近年来研究发现的与感觉功能有关的膜通道蛋白家族,在哺乳类动物,TRRP家族可分为6个亚家族,包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP及TRPML。TRPV4(又称OTRPC4)是TRPV家族成员之一,是一种由871个氨基酸组成的蛋白质。在人类,其基因定位于12q24.1。NiliusB等研究表明,TRPV4在哺乳动物组织中,主要存在于心脏,大脑,内皮,肾,感觉神经元,交感神经,脂肪组织,肠,唾液腺,肺,皮肤,汗腺,内耳和角质形成细胞。原位杂交实验显示,在小鼠大脑TRPV4的表达部位在大脑的终板层,终板血管器的神经元,视交叉,腹侧的海马联合,下丘脑,侧脑室脉络丛的室管膜细胞和脊髓背根神经节(dorsalrootganglia,DRG)神经元中。　　 TRPV4是一个非选择性阳离子通道,激活时可产生较强的钙离子内流。2002年,Guler等用TRPV4cDNA转染非洲爪蟾卵母细胞(Xenopusoocyte)和人胚肾293细胞(humanembryonickidneyHEK293cell),研究发现TRPV4可感受低渗透压刺激,并具有温控特性,可被27℃以上的温热刺激激活。TRPV4对温热刺激的反应也可被钉红抑制。　　 恒温动物正常体温的维持是在体温调节机制的调控下,产热和散热过程处于平衡。在寒冷刺激下,机体可通过战栗产热和非战栗产热维持体热平衡。非战栗产热又称代谢产热,主要有棕色脂肪组织和骨骼肌的非战栗产热两种形式。战栗样肌肉收缩是指在寒冷环境中,骨骼肌发生的不随意的节律性收缩,其节律为9-11次/分。发生战栗的肌肉在肌电图上表现出成簇的高波幅集群放电,这是许多肌纤维同步化放电的结果。战栗的特点是屈肌和伸肌同时收缩,所以不对外做功,产热量很高。驱动战栗反应的中枢在下丘脑背内侧核,该中枢发出的冲动经脑干脊髓外侧束,下达到脊髓前角运动神经元。这些冲动能增加肌紧张,肌紧张一旦超过临界水平,引起肌纤维收缩,就出现具有明显战栗特征的节律性震颤。震颤速率可达10-20次/秒,其效率可在数秒到数分钟内使产热提高许多倍。　　 KojiShibasaki等研究证明,在海马神经元中存在的TRPV4通过影响其神经元静息电位水平,调控海马神经元的兴奋性,进而影响海马神经元的功能活动。本实验室以往的研究提示,下丘脑中的TRPV4参与维持正常体温和LPS致大鼠发热过程。因此推测下丘脑背内侧核中的TRPV4可能参与调控在寒冷刺激下引起的战栗产热。　　 本实验旨在探讨下丘脑背内侧核(DMH)中TRPV4参与体温调节的中枢机制。应用寒冷刺激下大鼠战栗产热的模型,结合在DMH给予TRPV4特异性激动剂4-α-佛波醇-12,13-二葵酸(4-α-phorbol-12,13-didecanoate,4αPDD)或拮抗剂钌红(rutheniumred),观察在所设定的寒冷条件下动物体温的实时变动情况,DMH中TRPV4表达量和细胞内钙含量,同时检测发生战栗时骨骼肌的肌电反应强度。　　 方法：　　 1、实验动物及处理　　 (1)实验动物及分组　　 选用健康雄性SD大鼠72只,体重220～250g,基础体温(38.1±0.2)℃,由中国医科大学实验动物中心提供。将动物随机分为6组,每组12只:正常对照组(N)、单纯冷暴露组(C)、4aPDD组(P)、4aPDD+冷暴露组(P+C)、钌红组(R)、钌红+冷暴露组(R+C)。　　 (2)大鼠DMH部位插管和发射子植入　　 下丘脑DMH插管:将大鼠用10%水合氯醛按每公斤体重3毫升腹腔麻醉,将其头部固定于立体定位仪,切开皮肤,暴露出前囟。参照大鼠脑图谱,向下丘脑DMH(B:-3.3mm,L/R:0.5mm,H:9mm),插入不锈钢管,并留置与其相匹配的针芯,用牙托水加牙科水泥固定。　　 检测插管位置:试验结束后,向DMH中微量注射液体染料亚甲蓝1微升。随后用多聚甲醛经大鼠心脏灌流,取出经固定的大脑,并经过30%蔗糖溶液中脱水后,制备冰冻切片,显微镜下观察插管位置,参照大鼠脑图谱确定插管位置。　　 无线遥感体温发射子及肌电发射子植入:在麻醉状态下,大鼠腹腔植入无线遥感系统发射子,并将金属探头埋入大鼠骨骼肌中。术后动物单笼饲养,恢复一周后进行实验。　　 2、体温测量　　 应用BW-200生理无线遥测系统对大鼠体温进行测量。正式实验前一日早上8时开始记录大鼠基础体温,每隔30分钟测量体温1次,共测量6小时,取其平均值记为基础体温。实验均在早8时开始,各组在相应处理后开始监测体温变化,每隔5分钟自动记录体温一次,直至实验结束。　　 3、肌电测量　　 应用BW-200生理无线遥测系统测量大鼠骨骼肌肌电强度。　　 4、下丘脑DMH细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)测定　　 采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。　　 5、下丘脑DMH中TRPV4表达测定　　 (1)Westernblot方法检测下丘脑DMH中TRPV4表达。对照选用抗β-肌动蛋白抗体(β-actin)。目的蛋白与相应β-actin蛋白的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。　　 (2)免疫荧光检测:DMH中TRPV4的表达,并在荧光显微镜下观察、摄片。　　 6、数据分析　　 所有实验数据均用均数士标准差(x±s)表示,应用t检验比较各组均数间的差异,相关分析用相关性检验分析法。　　 结果：　　 1.与对照组(N)比较,单纯冷暴露组(C)的体温明显下降;肌电的幅度降低;DMH中TRPV4表达增加,细胞内钙离子浓度升高。　　 2.与单纯冷暴露组(C)比较,预先给予4aPDD后进行冷暴露(P+C),体温明显下降;肌电的强度降低;DMH中TRPV4蛋白表达、细胞内钙离子浓度高于C组。　　 3.与单纯冷暴露组(C)比较,预先给予钌红后进行冷暴露(R+C),体温与N组比较无明显差别,但明显高于C组;肌电的幅度也高于C组;DMH中TRPV4蛋白表达、细胞内钙离子浓度则均低于C组。　　 结论：　　 在寒冷环境下,下丘脑DMH中给予钉红或4aPDD,分别能增强或减弱战栗产热活动。