肿瘤的发生发展不是孤立事件,其所处局部微环境的变化对肿瘤的演进起着不容忽视的作用[1]。免疫细胞作为肿瘤微环境这一有机整体的重要组成部分,在其中发挥着双重作用[2,3]：一方面局部免疫细胞识别肿瘤细胞,诱导效应细胞浸润,杀伤肿瘤细胞；另一方面,肿瘤细胞通过与宿主免疫系统长期相互作用,被动“躲避”效应细胞免疫杀伤的同时,主动诱导抑制性细胞(如MDSC等)、分泌抑制性细胞因子(如TGF-β、IL-10、IDO和IL-35等)及表达共抑制分子(如CTLA-4、PD-L1和BTLA等),最终在肿瘤局部形成强大的抑制网络,通过多种机制使局部效应细胞功能减弱或“失能”,从而“逆转”局部免疫杀伤,实现其免疫逃逸[2]。多项临床研究也提示免疫微环境的反应状态影响着肿瘤的进展与预后[4,5],甚至有学者认为基于肿瘤局部浸润的淋巴细胞的种类、密度以及浸润部位的预后预测模型价值优于仅关注肿瘤本身状态的TNM与Duke分期[6]。T淋巴细胞是特异性免疫的核心,也是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,许多T细胞亚群在肿瘤免疫中的作用得到了深入研究与认识：细胞毒性T细胞及NKT细胞(Nature kill T cells; NK T cells)发挥抑癌免疫效应,辅助性T细胞向不同方向分化(如Th1、Th2、Th17、Treg细胞)也可发挥不同的抗癌或促癌免疫效应[7-9]。总体上,上述这些细胞均属于αβT细胞(T细胞受体双肽链由α链及β链构成),而与之相对应的γδT细胞(T细胞受体双肽链由γ链及δ链构成)由于在外周血中比例低(仅占成熟T细胞总数的5-10%),过去研究不受重视。然而,这群细胞在肝脏中特殊富集,可达局部总T细胞总数的25%,在肝脏中发挥重要的免疫监视作用[10],外周血单核细胞中γδT细胞的50-95%表达Vγ9Vδ2TCR[11]。相对于αβT细胞而言,γδT细胞有许多特殊的天然免疫系统特性：γδTCR具有高度多样性、不具MHC限制性和不依赖抗原的处理和呈递过程,表明γδT细胞在抗感染中起第一线的防御作用；γδT细胞可以不依赖于胸腺的发育,是一群兼有固有免疫、特异性免疫双重特征的T细胞,具有杀伤与调节双重功能,在局部免疫稳态的维持中发挥着不可替代的作用[12]；γδT细胞能调控免疫反应且具有毒杀多种癌细胞与被病毒感染的细胞的能力,但其对抗原的识别与αβT细胞并不相似,在历经长期进化后,γδT细胞以更广泛、快速和直接的方式对体内应激事件作出反应。在功能水平,γδT细胞和传统αβT细胞亚群具有共同的特征,比如分泌TNF-a和IFN-y等促炎性细胞因子或者显示杀伤活性[12,13]。皮肤γδδT细胞分泌的细胞因子(keratinocyte growth factor)对于损伤修复和上皮细胞再生有重要作用[14]。利用感染模型发现小鼠γδT细胞是早期IL-17的重要来源[15],也是早期IFN-y的来源[16]。肿瘤的研究中,体外实验表明γδT细胞能有效识别并杀伤多种实体肿瘤细胞(结直肠癌[17]、肾细胞癌[1δ]、卵巢癌[19]、骨髓瘤[20])及肿瘤干细胞[21])。γδδT细胞在体外和体外可以用IL-2扩增或唑来霉素诱导扩增用于临床研究,且其杀伤能力及表型标志不会有明显的改变,从而为以γδT细胞为基础的免疫治疗的临床应用提供了极大的便利[22]。临床试验显示黑色素瘤γδT细胞与病期负相关[23]；用于急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia; ALL)、急性髓细胞样白血病(Acute myeloid leukemia; AML)中提高无病生存期[24],导致apT细胞减少；用于非小细胞肺癌研究发现疾病进展显著抑制[25]。肝癌内尚未见有研究报道。但是部分研究发现有反应病例仅占总病例的10-33%；部分病例外周血中确有yδT细胞的扩增与活化,但对肿瘤生长无任何影响[26]。可能的原因主要有以下三点：1)肿瘤局部γδT细胞浸润缺陷。免疫细胞向肿瘤内定向迁移及定植是其发挥杀瘤作用的前提,而趋化因子表达异常可能导致抑制性免疫细胞趋化增多或者αβT细胞趋化增多,导致γδT细胞趋化受到抑制。2)肿瘤局部γδT细胞功能缺陷。肿瘤局部的免疫调节和抑制细胞(Treg、MDSC等)或抑制因子(IL-10、TGF-β、 IL-35等)以及共抑制分子(BTLA等)参与影响了γδT细胞的杀瘤效应。3)肿瘤内γδT细胞亚群发挥调节作用。在乳腺癌研究发现其在肿瘤微环境内有调节作用,诱导效应型T细胞衰老,抑制DC细胞成熟。γδT细胞在肝脏中特异性富集,肝组织中分离的γδT细胞在体外能有效地杀伤肝癌细胞系,这均提示γδδT细胞在肝脏中发挥重要的免疫监视作用[28]。我们发现γδT细胞在肝组织中的高浸润,同时发现γδT细胞在肝细胞癌中浸润明显减少和功能缺陷[27]。这表明,在体外具有抗癌效应的γδT细胞并不能有效地向肿瘤内迁移、定植,无法发挥抗癌效应。尽管有多项研究显示趋化因子介导了γδT细胞的定向迁移,但是在肝癌内尚未见报道。胚胎发育晚期,特定的趋化因子介导了γδT细胞向特定组织内的募集：如CCL27诱导向皮肤内趋化；CCL25介导肠道上皮内定植[29]。炎症状态下,CCL2、CCL25及CXCL10控制γδT细胞向炎症部位募集。慢性肝损伤中CCL20募集CCR6+γδT细胞到肝脏,并且通过抑制肝星状细胞保护肝脏以防止过度的肝炎和肝硬化,从而限制肝脏炎症的范围与程度[30]。角膜上皮损伤之后的修复过程包含CCL20依赖性的CCR6+IL-17+IL-22+γδT细胞的募集[31]。在过敏反应中CCL25通过α4β7整合素趋化IL-17+γδT细胞到炎症部位[32]。IL-23诱导的牛皮癣模型中γδT细胞的上皮浸润需要CCR6[33]。结核病中发现γδT细胞效应性亚群减少；炎症条件下γδT细胞分泌大量IL-17,参与早期炎症细胞的募集与活化。实验性肿瘤模型中目前仅有两项研究：炎症性趋化因子CCL2诱导CCR2+γδT细胞向小鼠黑色素瘤中浸润并发挥抗瘤效应[29]；在乳腺癌的研究中,肿瘤细胞分泌的IP-10在γδT细胞募集到肿瘤微环境起到重要作用[34]。但是目前的研究多在实验动物模型中,而哪一种趋化因子异常分布导致γδT细胞在人肝细胞癌内肿瘤微环境浸润减少仍然一片空白。为了进一步了解γδT细胞在肝细胞癌内的浸润机制,我们借助RayBio Human Antibody Array分析了高、低γδT细胞浸润组趋化因子和细胞因子的差异；另一方面我们借助全基因组芯片分析了肝细胞癌浸润性γδT细胞与癌旁浸润性γδT细胞之间的表达谱差异,发现"NK细胞介导的细胞毒通路(NK cell-mediated cytotoxicity pathway)”在肝细胞癌浸润性γδT细胞中显著下调；并从12个初筛标志中筛选出与该通路功能密切相关的关键转录因子显著下调(Eomes, p= 0.0035) [27].Eomes与T-bet同属T-box家族成员,两者在效应细胞的分化、功能调节中发挥不可或缺的作用。慢性感染状态下,CD8+T淋巴细胞中存在Eomes与T-bet的平衡：平衡偏向T-bet有利于免疫记忆；而平衡偏向Eomes则有利于免疫效应[35]。NK细胞的成熟分化也有赖于Eomes及T-bet的共表达,成熟NK细胞中敲除Eomes能使之向不成熟NK细胞发生逆分化[36]。此外,Eomes参与调节多种效应细胞(包括CD8+T淋巴细胞,NK细胞)的细胞毒功能、IFN-γ分泌、颗粒酶素B (GranzymeB)及穿孔素(Perforin)表达,从而最终影响效应功能的发挥[35,36]。有研究表明,γδT细胞活化后Eomes表达上调,伴随IFN-y分泌增高；而干扰Eomes表达后IFN-y分泌同步下调,而且该效应不依赖T-bet[37]。这一系列研究表明Eomes可能在肿瘤浸润淋巴细胞发挥效应功能同样起着关键转录因子的作用。本课题从肝细胞癌内γδT细胞浸润减少及效应功能受抑制的基本现象出发,研究γδT细胞效应功能受抑制的内在分子机制。本研究阐明了肝癌局部免疫抑制分子与γδT细胞作用的内在机制,丰富免疫逃逸理论,揭示肿瘤局部γδT细胞功能抑制的内在机制,对完善以γδT细胞为基础的免疫治疗策略以及探寻恰当的免疫治疗策略有很大的促进作用。第一部分肝细胞癌内γδT细胞浸润减少及功能缺陷的研究本研究旨在探索γδT细胞在肝细胞癌患者体内不同部位中(外周血、癌旁肝组织、肝癌病灶)的分布与和功能。通过不连续密度梯度离心法分离同一肝癌患者外周血单核细胞、癌旁浸润淋巴细胞(Peritumor infiltrating lymphocytes；PILs)及肝癌浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes；TILs),借助流式细胞技术分析不同部位γδT细胞分布及表型差异；借助RT-PCR技术分析不同部位γδT细胞表型差异；利用免疫组织化学染色分析肝癌组织及癌旁组织中γδT细胞浸润特点及绝对计数变化。结果发现,肝癌患者γδT细胞在配对的癌旁肝组织高于外周血(13.22±8.44%vs 12.96±8.82%,mean±SD:P=0.046),在肝癌组织中的浸润明显低于配对的癌旁肝组织(13.22士8.44%vs 6.33±5.61％,mean±SD:P=0.0002).免疫组化染色显示γδT细胞在实质区及间质区均有浸润；通过比较癌与癌旁单位面积中TCRG+细胞计数,发现肝癌内TCRG+细胞浸润明显减少,癌旁肝组织明显高于癌内(17.10士11.25 vs 4.42士15.40,mean士SD:P<0.001).肝癌组织中γδT细胞表达IL-12Rbl.IL-12Rb2和IL-18Ra比例,与配对的癌旁肝组织无明显差异,表达IL-18Rb的比例,癌内相对配对的癌旁肝组织有明显下降；CCL18和CD276mRNA癌内表达明显高于癌旁,而CD40 ligend和Fas ligend mRNA癌内表达明显低于癌旁。本实验表明肝癌组织内γδT细胞浸润较癌旁组织明显减少及功能缺陷。第二部分肝细胞癌内高、低γδT细胞浸润组趋化因子和细胞因子表达研究本研究目的是探索肝细胞癌高、低γδT细胞浸润组趋化因子和细胞因子表达差异。通过不连续密度梯度离心法分离同一肝癌患者癌旁浸润淋巴细胞(Peritumorinfiltrating lymphocytes; PILs)及肝癌浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes; TILs),借助流式细胞技术分析不同部位γδT细胞表达；利用RayBio(?) HumanAntibody Array检测趋化因子和细胞因子和γδT细胞浸润相关性及表达差异。结果发现274个检测指标中,12个趋化因子蛋白癌内相对癌旁上调,2个趋化因子癌内相对癌旁下调,10个细胞因子癌内相对癌旁上调,29个未分类因子癌内相对癌旁上调,10个因子癌内相对癌旁下调。相关分析发现CCL20与癌内γδT细胞负相关,Acrp30、MIP-3beta、ENA-78、FAS、b-NGF、MMP-8、MIF、 MICB、IL-8、IL-6R、VCAM-1、TMP-1、TIMP-2、PDGF-BB、 GRO、GRO-alpha和HGF与之正相关。MSP-3-alpha与癌旁γδT细胞正相关。综上所述γδT细胞浸润高低和肝癌内、癌旁多种细胞因子和趋化因子表达异常有关。第三部分TSLP、CCL5和Foxp3阳性细胞与γδT细胞的相关性研究本研究目的是探索肝细胞癌患者TSLP、CCL5和Foxp3阳性细胞与γδT细胞表达相关性。通过免疫组织化学方法分析TSLP、CCL5和Foxp3与γδT细胞表达差异及相关性。分析后发现γδT细胞与Foxp3阳性细胞在癌内无相关性,在癌旁却呈正相关。TSLP与癌内γδT细胞两者间存在负相关性。TSLP和CCL5与Foxp3的表达无相关性。结论：TSLP和CCL5对γδT细胞异常分布有重要作用。第四部分转录因子Eomes与肝癌预后的相关研究转录因子Eomes是介导IFN-γ分泌的重要转录因子,其表达异常与淋巴细胞的激活和分化有重要相关性。本研究旨在通过分析Eomes与肝癌患者预后及淋巴细胞亚群的相关性,探讨转录因子在塑造肝细胞癌免疫微环境中的作用。通过组织芯片免疫组织化学染色,分析Eomes在331例肝癌组织及癌旁组织中的表达情况。结果显示,Eomes阳性细胞主要在分布在肿瘤间质中。相对于癌旁组织,癌组织中的γδT细胞浸润程度明显减少(平均值,28.60 vs.67.75,P<0.0001)。阳性计数后利用“最小P值法”得到最佳临界Eomes个数,癌旁为15,癌为10。可将病例分成癌旁高浸润组(n=293)及低浸润组(n=38)；癌内高浸润组(n=168)及低浸润组(n=163)。单因素预后分析发现,癌旁Eomes阳性细胞低浸润组总体生存率(Overall Survival; OS)低于癌旁高浸润组(OS,P=0.009),复发时间(Time to recurrence; TTR, P=0.292)无明显差异。将有意义的临床病理特征因素与癌旁Eomes阳性细胞纳入COX风险比例模型中进行多因素分析,结果显示癌旁Eomes是肝癌患者OS的独立预测指标(P=0.028)。另外我们发现癌旁Eomes阳性细胞亦可作为BCLC患者OS的独立预测指标(P=0.006)。同时,我们对癌内细胞进行单因素预后分析,发现癌内Eomes阳性细胞低浸润组OS低于高浸润组(OS,P=0.018；TTR, P= 0.338)。将有意义的临床病理特征因素纳入COX风险比例模型中进行多因素分析,结果显示癌内Eomes阳性细胞不是肝癌患者OS的独立预测指标(P=0.374)。另外我们发现癌内Eomes阳性细胞亦非BCLC患者OS的独立预测指标,分析结果为(P=0.328)。运用流式细胞术发现,不同部位转录因子Eomes表达比例有明显差别,γδT细胞和CD3+CD56-亚群表达比例癌内相对于癌旁有明显降低(图5)。本研究表明γδT细胞和CD3+CD56-亚群Eomes比例下调导致其表达和肝癌患者预后相关。结论1 γ6T细胞在肝癌内浸润减少和功能缺陷。2 γδT细胞浸润高低和肝癌内、癌旁多种细胞因子和趋化因子表达异常有关。3 TSLP和CCL5对γδT细胞异常分布有重要作用4 γδT细胞和CD3+CD56-亚群Eornes比例下调导致其表达和肝癌患者预后相关。创新点1 首次利用抗体芯片筛选与γδT细胞浸润相关趋化因子和细胞因子2首次明确γδT细胞在肝癌内浸润与趋化因子TSLP的相关性。3首次明确肝癌内转录因子Eomes在肝癌内表达水平与肝癌患者预后相关,并且定位于亚群细胞。