论文部分内容阅读
研究背景：移植性血管病(transplant vasculopathy, TV)是一种以移植物血管新内膜形成为主要特点的增殖性血管疾病。器官移植后90%的患者在10年内发展成TV。近年来,随着免疫抑制剂的发展和应用,器官移植后急性排斥反应的发生得到较好的控制,而器官移植后以移植性血管病为主要表现的慢性排斥反应成为影响移植物长期存活的主要因素。如何有效地减轻移植后血管损伤和提高移植物的长期存活率,是目前器官移植领域的重要课题。TV的血管内膜增生是人们一直关注的焦点,关于其发生机制的研究多数都集中在血管中膜平滑肌细胞的增殖并向内膜迁移,以及血管壁炎细胞浸润、内皮细胞损伤并分泌多种细胞因子,从而促使血管内膜增厚继而发生血管腔狭窄。而血管外膜一直被认为是对血管起营养和支持作用的一层结缔组织,未引起人们的足够重视。近些年来,研究者开始关注血管外膜的作用,并发现外膜在动脉粥样硬化形成、动脉球囊损伤等病变中发挥重要作用。并有研究证明,当血管受到细胞因子和牵拉、机械损伤等刺激后,外膜的成纤维细胞可以被激活,发生表型转化、增殖和迁移能力增强等改变,参与了血管的重构。说明血管外膜在涉及血管重塑的疾病中有重要作用。另外,NADPH氧化酶在心血管疾病中的重要作用已有很多报道,如动脉粥样硬化病灶的形成和发展与NADPH氧化酶的活性密切相关。而且有研究者证明,NADPH氧化酶参与外膜成纤维细胞的氧化应激,进而使外膜成纤维细胞被激活,继而诱导血管重塑的发生。然而,NADPH氧化酶在血管外膜中的表达以及如何在外膜中发挥作用,引起移植性血管病的发生、发展,少有人研究。本课题主要就外膜中NADPH氧化酶、外膜炎症及外膜血管新生对血管重构的作用进行探讨和研究。研究目的：建立大鼠胸-腹主动脉移植模型,通过体内外实验验证移植性血管病起始于外膜的激活,外膜成纤维细胞中NADPH氧化酶在蛋白和mRNA水平上的高表达,促进了外膜成纤维细胞增殖、迁移能力的变化,探讨血管外膜以及外膜成纤维细胞激活在移植性血管病新内膜形成及发展中的作用及外膜炎症和新生血管的生成对新生内膜可能的促进作用。研究方法：体内实验：取F344雄性大鼠的胸主动脉为供体血管,用袖套管技术移植到Lewis雄性大鼠腹主动脉建立实验模型,移植血管作为实验组,未移植F344雄性大鼠胸主动脉作为正常对照组。移植实验组于血管移植后0.5,3,7,14天,分别取出移植的胸主动脉进行HE染色,测量移植血管的内膜、中膜、外膜增生情况及内膜/中膜厚度比值。免疫组织化学染色检刂p47phox和gp9 lphox及CD68和CD3的表达。分离血管外膜组织,用QRT-PCR方法在mRNA水平上检测移植实验组0.5,3,7,14天各时间点血管外膜gp91phox和p47phox的表达。体外实验：分离雄性F344胸主动脉外膜及F344-Lewis移植14天血管外膜成纤维细胞分别做原代培养。取原代细胞培养的3-5代细胞进行实验。比较两种细胞增殖和迁移能力的差别；QPCR比较两种原代成纤维细胞的p47phox mRNA的表达水平。p47phox-siRNA特异性敲除p47phox后观察细胞功能的变化：将移植14天血管外膜原代成纤维细胞分成三组,空白对照组(未转染组),阴性对照组及p4 7phox-siRNA转染组,对三组细胞分别进行Brdu染色检测细胞增殖、transwell小室实验检测细胞迁移能力；Diapocynin抑制NADPH氧化酶后观察细胞功能的变化：移植14天血管外膜原代成纤维细胞分成空白组,DMSO组(对照组)及Diapocynin组,CCK-8检测三组细胞增殖能力,transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力。研究结果：1.移植血管外膜增生先于新内膜形成HE染色结果显示,与正常对照组比较,移植血管组各时间点的外膜从3天开始明显增厚,7天继续增厚,14天增厚更为明显；内膜从7天开始增厚,14天增厚明显；而中膜的厚度在0.5天、3天、7天、14天各时间点无显著差异。2.移植血管外膜中NADPH氧化酶的表达上调免疫组化结果显示,gp91phox与p47phox的阳性细胞最早出现在移植后3天的动脉外膜,并随时间延长表达逐渐增多；移植后7天内膜开始出现gp91phox与p47phox的阳性细胞,14天继续增多。QPCR结果表明与正常对照组比较,移植血管外膜的gp91phox 和p47phox的mRNA的表达水平从3天开始随着移植天数的延长而逐渐增高,并有统计学意义。3.移植血管外膜中炎细胞的浸润 单核-巨噬细胞移植后3天即在外膜中出现,7天和14天随时间延长逐渐增多；单核-巨噬细胞在移植后7天出现在内膜,14天较7天增多。T细胞数在血管移植后随移植天数的延长无显著差异。4.抑制移植血管外膜成纤维细胞中NADPH氧化酶表达,细胞增殖迁移能力下降 移植14天血管外膜原代成纤维细胞转染p47phox-siRNA和Diapocynin干预,细胞的增殖和迁移能力均明显受到抑制。5.血管外膜中新生血管形成与新内膜形成相关 移植后3天血管外膜中未发现新生血管,移植后7天新生血管开始出现,14天明显增多。外膜新生血管数的增加与内膜增厚趋势一致,两者显著相关。研究结论：1.在移植性血管病中,外膜的激活最早发生,NADPH氧化酶高表达作为外膜活化的表现之一,提示可能对新内膜的形成起重要作用。2.NADPH氧化酶高表达使外膜成纤维细胞的增殖和迁移能力增强,可能参与促进了新生内膜的形成。3.外膜巨噬细胞的浸润、新生血管的增多,可能进一步促进血管重塑。