阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种以进行性认知障碍、记忆力减退为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。其病因目前尚不清楚，有证据表明，线粒体结构功能紊乱和β—淀粉样蛋白(β amyloid peptide，Aβ)的毒性作用是AD发病的重要因素。端粒酶(telomerase)是细胞内一种特殊的核糖核蛋白逆转录酶，能够以自身RNA为模板合成染色体末端端粒的重复序列(TTAGGG)，从而维持端粒长度，避免细胞复制性衰老和凋亡。近年众多的研究表明端粒酶和(或)其催化亚基端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)还具有独立于端粒外的抗凋亡作用和调节神经细胞生存的作用，目前探讨端粒酶的神经保护作用机制已成为研究的热点，这为神经退行性疾病如AD的防治策略带来新的亮点。 氧化应激和线粒体DNA缺陷是散发型AD(SAD)发病的重要因素。AD患者mtDNA基因存在一定程度的基因突变，特别是在mtDNA调控区，并有随年龄增加而加剧的趋势。许多证据显示端粒酶具有明显的抗氧化应激和保护线粒体的功能。通过基因转染技术将hTERT导入端粒酶活性阴性的细胞后能显著提高细胞抵抗各种促凋亡剂的毒性作用，线粒体膜电位升高，活性氧减少，mtDNA受到保护。而抑制端粒酶阳性的细胞则显著增强各种促凋亡剂的毒性作用。大量研究表明雌激素具有明显的抗氧化应激和延缓衰老的作用，流行病学调查发现雌激素替代疗法可以预防AD的发病率，提高AD患者的认知能力。有研究表明雌激素可以通过提高端粒酶活性延缓细胞的衰老。 基于以上发现，本课题利用已构建的hTERT基因重组腺病毒载体(Ad—hTERT)转染人胚胎皮质神经元，观察外源性hTERT是否对Aβ25-35诱导的人胚胎皮质神经元损伤具有保护作用及可能机制。然后利用端粒酶活性阳性的人神经母细胞瘤细胞系SH—SY5Y构建SAD胞质杂交细胞，通过检测它们在培养过程中线粒体形态结构和功能的变化，此变化对内源性端粒酶活性的影响以及雌激素干预后对hTERT mRNA表达的影响，以探讨端粒酶在氧化应激状态中可能的作用和影响。本课题的完成将为探索以端粒酶为靶点的AD基因治疗策略提供基础性资料。 材料与方法： 1.端粒酶逆转录酶对Aβ25-35诱导的人胚胎皮质神经元损伤的神经保护作用 分离和培养12～20周龄人胚胎皮质神经元，Ad—hTERT基因重组腺病毒转染，免疫细胞化学法检测hTERT的表达。转染后第3d天给予10μmol/L Aβ25-35作用24 h，MTT检测细胞活力，荧光探针DCFH—DA检测细胞内ROS水平，GSH检测试剂盒(比色法)测定细胞匀浆中GSH含量。 2.ρ0细胞和SAD胞质杂交细胞的构建与鉴定 采用SH—SY5Y细胞作为每细胞进行ρ0细胞的构建，在培养基中加入5μg/ml和7.5μg/ml溴化乙锭长期作用SH—SY5Y，第10周左右开始行透射电镜观察线粒体形态变化和用PCR法扩增mtDNA编码的目的基因细胞色素C氧化酶(COX)。ρ0细胞构建成功后，与SAD患者和正常对照老人血小板进行融合，融合成功后培养基内撤出丙酮酸、尿苷进行筛选，透射电镜和mtDNA PCR法鉴定。 3.SAD胞质杂交细胞的线粒体结构和功能的变化 培养早期和晚期SAD胞质杂交细胞CTL胞质杂交细胞、ρ0细胞和SY5Y细胞分别采用以下方法观测线粒体的形态和功能：透射电镜观察线粒体结构变化，MTT检测细胞活力，荧光探针DCFH—DA检测细胞内ROS水平，GSH检测试剂盒(比色法)检测细胞匀浆中GSH含量，COX活性检测试剂盒(分光光度计法)测定COX活性，JC-1染色后行流式细胞术和激光共聚焦显微镜术检测线粒体膜电位的变化。 4.SAD胞质杂交细胞端粒酶活性的变化及雌激素干预对其hTERT mRNA表达的影响 分别采用端粒酶活性试剂盒、实时荧光定量RT—PCR和Western blot检测培养早期和晚期SAD胞质杂交细胞、CTL胞质杂交细胞、ρ0细胞和SY5Y细胞的端粒酶活性、hTERT mRNA及其蛋白的表达。 培养晚期各组加入1μg/ml17β—雌二醇作用72 h后行实时荧光定量RT—PCR检测hTERT mRNA的表达。 结果： 1.端粒酶逆转录酶对Aβ25-35诱导的人胚胎皮质神经元损伤的神经保护作用 免疫细胞化学术显示重组腺病毒转染人胚胎皮质神经元后72 h hTERT的表达最高，以后逐渐减弱；10μmol/L Aβ25-35干预神经元后，神经元的细胞活力和GSH含量与对照组比较显著降低(t=2.925，P<0.05和t=4.528，P<0.01)，ROS水平明显增加(t=4.021，P<0.01)；而预先转染了Ad—hTERT的神经元组，与未转染Aβ25-35组比较其细胞活力和GSH含量显著升高(t=2.786，P<0.05和t=4.052，P<0.01)，ROS水平明显降低(t=2.672，P<0.05)。 2.ρ0细胞和SAD胞质杂交细胞的构建与鉴定 SH—SY5Y细胞经过7.5μg/ml溴化乙锭持续作用95 d后，ρ0细胞构建成功。电镜下可见ρ0细胞线粒体肿胀变圆，基质消失，变成只剩外壳的“鬼影样”结构，线粒体嵴极少且变形。mtDNA PCR扩增结果未见目的条带。SAD和CTL胞质杂交细胞经过ρ0细胞与SAD患者和正常对照老人血小板融合、筛选后经电镜和PCR检测重新出现了正常线粒体和mtDNA，构建成功。 3.SAD胞质杂交细胞的线粒体结构和功能的变化 到培养晚期SAD胞质杂交细胞异常线粒体明显增多，线粒体肿胀，基质电子密度低呈斑片状，嵴变形扭曲甚至断裂、数量明显减少、分布不均；而在培养早期，SAD胞质杂交细胞只含少量异常线粒体；培养晚期CTL胞质杂交细胞线粒体形态正常，与培养早期差别不大；ρ0细胞线粒体呈圆的空泡状或“鬼影样”结构，与培养早期无明显变化。 培养晚期SAD胞质杂交细胞的GSH含量、COX活性、膜电位水平明显低于培养早期SAD胞质杂交细胞，差异有统计学意义(t=8.048，P<0.001；t=12.758，P<0.001和t=2.751，P<0.05)，也显著低于培养晚期CTL胞质杂交细胞(t=23.06，P<0.001；t=26.862，P<0.001和t=3.876，P<0.01)；培养晚期SAD胞质杂交细胞的ROS水平显著高于培养早期SAD胞质杂交细胞(t=8.829，P<0.001)，也显若高于培养晚期CTL胞质杂交细胞(t=12.252，P<0.001)；ρ0细胞各项指标在培养早、晚期大多指标变化不明显。 4.SAD胞质杂交细胞端粒酶的活性及雌激素干预对其的影响 在培养早期，SAD胞质杂交细胞端粒酶活性、hTERT mRNA和蛋白表达与CTL胞质杂交细胞差别不大；而到培养晚期，SAD胞质杂交细胞的端粒酶、hTERTmRNA及其蛋白的表达明显低于同期CTL胞质杂交细胞(t=5.87，P<0.01和t=3.842，P<0.01)，也显著低于培养早期SAD胞质杂交细胞(t=2.938，P<0.05和t=2.686，P<0.05)；在培养早、晚期，ρ0细胞的端粒酶活性、hTERT mRNA和蛋白表达均比同期SY5Y细胞明显降低。 培养晚期各组细胞加入1μg/ml17β—雌二醇作用72 h后，SAD胞质杂交细胞hTERT mRNA的表达比未加17β—雌二醇SAD胞质杂交细胞组明显提高(t=2.938，P<0.01)。其它各组加入前后变化不明显。 结论： 1.hTERT对Aβ25-35引起的人胚胎皮质神经元的损伤有保护作用并降低ROS水平和升高GSH含量； 2.成功构建ρ0细胞、SAD胞质杂交细胞和CTL胞质杂交细胞，为下一步的研究奠定了细胞模型基础； 3.SAD胞质杂交细胞由于SAD患者本身线粒体基因的缺陷导致线粒体形态结构和功能加速异常，其细胞活力、COX活性、GSH含量和膜电位显著下降，而ROS显著升高； 4.SAD胞质杂交细胞在培养晚期氧化应激状态的增加可能导致其端粒酶活性降低、hTERT mRNA及其蛋白表达下降； 5.雌激素可提高培养晚期SAD胞质杂交细胞的hTERT mRNA的表达； 6.ρ0细胞是一个独特的细胞类型，其形态结构和功能在培养早、晚期变化不大。