中性粒细胞-淋巴细胞比识别冠状动脉粥样硬化非钙化斑块或混合斑块的临床价值背景:冠心病是世界上导致人类死亡主要疾病之一,由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管狭窄或阻塞。急性冠状动脉事件发病凶险,严重危及生命。研究表明,约75%的急性冠脉事件是由不稳定斑块的破裂引起的。动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程,在斑块的形成、发展、破裂和血栓形成中始终有炎性细胞和炎症因子的参与。中性粒细胞为外周血第一大类炎性细胞,可被招募进入斑块组织,通过分泌诸多炎性因子参与斑块的发展、破裂和血栓的形成。临床研究表明中性粒细胞-淋巴细胞比(neutrophil to lymphocyte ratio;NLR)在识别冠状动脉狭窄程度和后期心血管不良事件预后中具有重要的临床价值。多项研究证实冠状动脉存在非钙化斑块或混合斑块的患者后期不良心血管事件风险显著高于无斑块和钙化斑块人群。然而NLR与冠状动脉非钙化斑块或混合斑块之间的关系仍不明确。目的:探讨NLR识别冠状动脉粥样硬化非钙化斑块或混合斑块的临床价值。方法:回顾性收集598例来我院行冠状动脉CT造影检查人群的临床和实验室相关检测数据。冠状动脉粥样硬化斑块分为钙化斑块、非钙化斑块和混合斑块。受试者如冠状动脉同时存有多种类型的斑块,则记录引起冠状动脉狭窄程度最大的斑块为该受试者的斑块组别。共计有167例患者CT检查无粥样硬化斑块,记录进入无斑块组;219例患者入组钙化斑块组;非钙化斑块或混合斑块组中有212例患者。结果:非钙化斑块或混合斑块组患者外周血NLR数值显著高于无斑块组和钙化斑块组。将NLR进行三分位分析发现NLR高分位组中非钙化斑块或混合斑块的比例显著高于NLR低分位组;相反,无斑块人群在NLR低分位组和中分位组中的比例显著高于NLR高分位组。相关性分析显示NLR与高敏C反应蛋白(r=0.177,p<0.001)存在显著的相关性。多因素分析表明NLR与冠状动脉存在非钙化斑块或混合斑块独立相关(OR=1.195;95%CI:1.020-1.400;p=0.028),高水平NLR的患者冠状动脉存在非钙化斑块或混合斑块的风险显著高于低水平NLR患者(OR=1.751;95%CI:1.127-2.721;p=0.013)。结论:NLR是识别冠状动脉非钙化斑块或混合斑块的独立危险因素。研究结果提示,中性粒细胞和淋巴细胞计数这类成本低且易检测的常规实验室血液检查指标在识别冠状动脉非钙化斑块或混合斑块以及监视动脉粥样硬化患者病情发展中具有潜在的重要价值。溶血磷脂酸通过肽基精氨酸脱氨酶4信号通路调控中性粒细胞分泌细胞外捕网稳定血栓的研究背景:血栓栓塞是一种在动脉或者静脉中形成血凝块而导致的潜在致死性疾病。如何阻止血栓的形成、发展及促进血栓形成后的降解一直是医学研究领域关注的重点。中性粒细胞胞外捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞发挥功能的一种新的形式。NETs可网集红细胞、血小板以及血浆中的蛋白等参与血栓的形成和发展。此外,NETs参与形成的血栓不能被常规的溶栓药降解,提示NETs诱导形成的血栓不同于单纯纤维蛋白凝聚形成的血栓,为临床常规溶栓治疗效果不佳指出了可能存在的原因及溶栓治疗的新靶点。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一类具有生物活性的磷脂小分子,LPA可诱导血小板的形态变化和聚集,提示LPA在血栓的形成、发展过程可能扮演着重要的作用。LPA已知可调控多种细胞的生物学功能,诸如增殖、迁移、凋亡等。然而LPA是否可以作用于中性粒细胞分泌NETs参与血栓的发展,目前尚无研究报道。目的:探讨LPA对中性粒细胞分泌NETs的诱导作用及机制,同时明确LPA通过NETs对血栓发展的影响。方法:收集我院急性肺栓塞(acutepulmonary embolism,APE)患者和对照组人群的实验室检查数据及外周静脉血血浆,通过荧光定量、ELISA方法以及质谱法检测血浆中NETs和LPA含量。收集慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH)患者外科手术的血栓标本,免疫荧光检测NETs和LPA的生成酶自分泌运动因子(autotaxin ATX)。实时荧光定量PCR检测外周血中性粒细胞LPA1-6受体的表达情况。此外,利用SytoxGreen荧光染料检测LPA对人外周血中性粒细胞分泌NETs的影响。Western Blot检测细胞信号转导通路关键蛋白质及其磷酸化的表达水平。Graphd Prism 7软件对数据进行统计分析和作图,P<0.05为具有显著差异。结果:研究结果显示APE患者外周血中性粒细胞含量显著升高,同时血浆中双链DNA(dsDNA)、瓜氨酸化的组蛋白H3(citH3)和核小体的水平也显著高于对照组人群。质谱检测发现LPA含量在APE患者血浆中也显著升高。组织水平检测发现NETs和LPA的生成酶ATX存在于CTEPH患者的血栓标本组织中,且二者存在共定位的现象。通过SytoxGreen荧光观察发现LPA可以显著的诱导中性粒细胞分泌网状DNA,其可被DNaseⅠ降解。免疫荧光鉴定发现该网状物有citH3和MPO,符合NETs的鉴定标准,证实LPA可以诱导中性粒细胞分泌NETs。此外,对比佛波酯(PMA)刺激,发现LPA可以快速的诱导NETs的释放,在诱导90min即可使NETs分泌水平达到平台期。中性粒细胞中LPA受体亚型分析表明,中性粒细胞高表达LPA2受体亚型,其次为LPA6受体亚型,然而阻断LPA1-5受体亚型对LPA诱导NETs的分泌没有显著影响,推测可能是LPA6介导LPA诱导NETs的分泌过程。进一步,研究发现阻断mTOR、PKA、PKC和肽基精氨酸脱氨酶4(PAD4)可以显著的抑制LPA诱导的组蛋白H3的瓜氨酸化水平和NETs的分泌,提示LPA可能通过多条信号通路调控PAD4参与诱导NETs的分泌。功能分析发现LPA诱导的NETs可以网集血浆中的纤维蛋白原、纤连蛋白以及血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF);且LPA诱导的NETs参与形成的血栓在DNase Ⅰ辅助溶栓药组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)作用下可以进一步的降解。组织病理学分析发现,tPA处理后的残余血栓组织中存在大量的网状NETs,纤连蛋白在NETs上沉积。此外,LPA诱导的NETs可以进一步活化血小板分泌LPA,提示可能存在LPA-NETs信号的级联放大效应。结论:LPA通过诱导中性粒细胞快速分泌NETs在血栓的稳定性中发挥着重要的作用。研究结果提示阻断LPA-NETs信号通路可能成为一种临床预防和治疗静脉血栓栓塞疾病的潜在新靶点