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猪瘟是危害养猪业的主要传染病,为了得到大量的猪瘟病毒特异性诊断抗原,并试图在真核细胞中大量表达猪瘟病毒特有的免疫保护性抗原,即E2囊膜糖蛋白,为进一步制备猪瘟亚单位疫苗有效预防本病奠定基础。本试验首次克隆了我国地方分离株HL-LY E2囊膜糖蛋白基因,将该基因整合到毕赤酵母表达系统,使该基因获得了高效表达,并在此基础上探索了不同外界条件对表达量的影响,主要结果如下: 根据基因库已发表的猪瘟病毒E2基因序列及毕赤酵母表达载体pPIC9的多克隆位点序列,利用Oligo和Primer5.0等软件设计并合成一对引物,以提取猪瘟病毒HL-LY株总RNA为模板,应用RT-PCR技术,扩增得到E2基因。将该基因片段先克隆到pMD18-T载体上,并进行了酶切、PCR鉴定和测序分析,阳性重组质粒命名为T-E2。运用DNAMAN软件将测序结果与国内外已发表的猪瘟病毒Alfort株,Brescia株,SHIMEN株,C株,C-V-LZ株,GS-LT株和GS-LX株的E2基因全序列和E2基因主要抗原区序列(23bp~545bp)的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较,E2基因全序列核苷酸的同源性分别为:99.20%,95.44%,96.51%,95.53%,89.12%,78.66%,78.23%;主要抗原区核苷酸的同源性分别为:98.90%,95.05%,96.70%,96.15%,95.42%,82.42%,83.15%。E2基因全序列氨基酸的同源性分别为:98.93%,95.98%,97.32%,95.71%,89.54%,83.16%,83.42%;主要抗原区氨基酸的同源性分别为:98.35%,95.05%,97.25%,95.60%,95.05%,87.36%,88.46%。结果表明E2基因主要抗原区和全序列均具有较高的保守性,与国内外代表毒株Alfort株,Brescia株,SHIMEN株,C株同源性较高,而与国内其他毒株C-V-LZ株,GS-LT株,GS-LX株同源性较低,说明我国部分地区猪瘟病毒存在E2基因突变株。 将重组质粒T-E2的E2基因酶切后,亚克隆到表达载体pPIC9上,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9-E2。重组表达载体pPIC9-E2经Sal Ⅰ酶切线性化后,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组上,经PCR鉴定和PCR产物测序分析,阳性转化子命名为GS115-pPIC9-E2。 将GS115-pPIC9-E2在30℃条件下振荡培养,以1%的甲醇诱导,猪瘟病毒E2融合蛋白获得了表达,表达量为0.34g/L。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的融合蛋白分子量大小为50-54ku,且具有天然蛋白的抗原特异性。 通过对表达条件如pH值、通气量、诱导甲醇终浓度、培养基的选择等条件的探索,可确定猪瘟病毒HL-LY株E2基因表达的理想条件为:最适pH值在4.0~6.0之间,最适培养基为MM培养基,最佳诱导的甲醇终浓度为1%,加大通气量时表达量较好。