研究背景:脊髓损伤多由高空坠落或交通事故所致,是脊柱外科的常见病、多发病,也是临床治疗的难点和基础研究的热点。应用神经营养药物进行保守治疗是重要的治疗手段之一。然而,由于血脑屏障的存在,口服或静脉注射等传统给药方法很难达到持续的药物有效浓度,并最终作用于损伤的脊髓部位。因此,开发一种有效的、能够直接作用于损伤段脊髓的药物传递系统,对于治疗脊髓损伤非常重要和关键。目的:（l）构建一种由泊洛沙姆407（Poloxamer407,简称Pol-1）和泊洛沙姆188（Poloxamer 188,简称Pol-2）合成的药物-凝胶传递系统,并明确其结构形式。（2）将有明确神经营养作用的药物包裹于凝胶系统中,构建原位作用于损伤段脊髓的药物-凝胶传递系统。（3）通过建立动物脊髓半横断损伤模型,明确该药物-凝胶传递系统的神经修复及营养作用。方法:体外实验:这种原位凝胶药物传递系统,是由泊洛沙姆407（Poloxamer 407）和泊洛沙姆188（Poloxamer 188）合成的温度敏感型水凝胶,将有治疗作用的神经节苷脂（GM1）包裹其中。本实验中,采用冷溶法制备水凝胶:称取一定量的无菌泊洛沙姆407（Pol-1,平均分子量≈12600,PEO101-PPO66-PEO101;BSAF,Germany）和泊洛沙姆 1 88（Pol-2,平均分子量≈8400,PE080-PP027-PEO80;BSAF,Germany）,混合均匀后,在持续搅拌下缓慢加入到无菌4℃冰水中,然后置于4℃冰箱中冷藏过夜,使凝胶充分溶胀分散均匀,得到澄清的溶液。GM1-水凝胶的制备:是将GM1溶液（5mg/mL;山东齐鲁制药公司生产;China）加入到已制备好的水凝胶溶液中。为了保证加入GM1后GT≈37℃根据线性方程,空白水凝胶和GM1-水凝胶中总的聚合物浓度为22.9%。为了研究水凝胶凝胶化过程中的弹性模量G’和粘性模量G”,我们将温度升高的速度控制在1℃/fnin。包裹着GM1的泊洛沙姆（Poloxamer）温敏型水凝胶（简称GM1-水凝胶）在室温下为溶液形态,当用微量注射器注射至脊髓损伤部位时,由于温度的升高,温敏型水凝胶由溶液形态快速转变为半固体形态,并且局限在脊髓损伤部位,从而能持续缓慢释放GM1长达1个月之久。粘弹性检测:使用流变仪对单纯Pol-1、单纯Pol-2、空白水凝胶和GM1-水凝胶的粘弹性进行检测。实验中,通过监测温度方面的粘弹性参数和凝胶组合物上的胶凝温度（GT）的影响来研究凝胶化过程。在本研究中,运用扫描电镜观察水凝胶结构,运用高效液相色谱法检测其药物释放曲线。在体外实验条件下,使用人工脑脊液（aCSF）来模拟体内的坏境来进行体外GM1-水凝胶的药物释放的研究。作为用于实验动物体内应用支持数据,我们绘制了在25℃和37℃条件下,水凝胶在人工脑脊液的释放曲线。动物体内实验:本研究动物实验中,实验动物均选用SD大鼠（Sprague-Dawley rats）,由南京医科大学实验动物中心提供,取60只,均为雄性,体重170-220g,SPF级。采用大鼠T10椎体平面脊髓半横断模型。实验中SD大鼠共分为四组:aCSF（人工脑脊液）组（Ⅰ）,即注射20ul体积的aCSF（人工脑脊液）,15只大鼠;空白水凝胶溶液组（Ⅱ）,即注射20ul体积的空白水凝胶溶液,15只大鼠;GM1溶液组（Ⅲ）,即注射20ul体积的GM1溶液（5mg/mL）,15只大鼠;GM1-水凝胶溶液组（Ⅳ）,即注射20ul体积的GM1-水凝胶溶液,15只大鼠。实验中,用Basso,Beattie和Bresnahan评分（BBB评分）评价大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。分别由两位实验者,双盲分别对大鼠运动功能进行评分。术后立即、1天、3天、7天、14天、21天、28天分别对大鼠运动功能分别进行评分,通过BBB评分观察、评估大鼠脊髓损伤、治疗之后运动功能恢复情况,并进行相应的统计学分析。为了研究大鼠运动功能恢复的机制,检测在损伤脊髓的周围区域的早期细胞元死亡的范围,这个范围是通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术（TUNEL）所表达。为了进一步了解脊髓损伤后GM1-水凝胶的显著治疗效果,我们分别通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经丝200（NF200）的免疫组化分析,检查病变部位附近的星形胶质细胞和轴突生长,进行形态学观察、检测及量化分析。结果:体外实验结果:（1）在凝胶形变期间,存储在材料中的弹性或能量可由弹性模量（G’）描述;粘性模量（G”）描述了粘性特性或作为热耗散的能量。GT为弹性模量在溶液状态和凝胶状态交界值的温度。在Pol-1材料中,GT值大约是15℃,但是在Pol-2材料中,直到45℃都没有观察到GT值（GT应>45℃）。Pol-1的浓度越高,水凝胶的GT越低。因为Pol-2浓度的影响,GT先增加到最大值,然后再逐渐下降。实验中发现,室温下的聚合物溶液,能够在升高温度至37℃条件下,可逆地转化为水凝胶。同时使用扫描电镜发现,泊洛沙姆（Poloxamer）温敏型水凝胶为多孔的网状结构,适合装载药物,并且在包裹GM1后,其多孔网状结构未被破坏。（2）高效液相色谱法发现,具有高弹性模量和更致密网络结构的水凝胶,能够持续释放包裹着的GM1。在室温25℃条件下,从GM1-水凝胶中,在第一天后约有60%的GM1释放到脑脊液中,之后释放曲线持续升高直到第四天。当温度升高至37℃的时候,GM1持续地从水凝胶释放到人工脑脊液中,持续大约1个月。因此GM1从GM1-水凝胶的释放过程,表现为受温度控制逐渐释放出GM1药物。并且根据实验中GM1的释放结果,绘制了分别在25℃和37℃脑脊液条件下水凝胶的释放曲线。动物体内实验:（1）在脊髓损伤后,各组的动物均出现了完全性后肢麻痹（BBB评分=0）。用GM1-水凝胶处理治疗的大鼠,相比于单纯使用aCSF大鼠组、水凝胶组、GM1治疗组来说,在伤后第14天时开始展现出更好的功能恢复效果,并且在本研究的剩余观察时间内一直保持了这个优势。此外,与人工脑脊液组相比,GM1组和空白水凝胶组分别在创伤后21天和28天,可以看到一定程度的大鼠运动功能恢复。（2）TUNEL实验表明,脊髓损伤后的第3天和第7天,与对照组相比,包裹GM1-水凝胶治疗组,其TUNEL阳性细胞数明显减少。GM1-水凝胶可以有效地降低在脊髓损伤中的细胞凋亡。因此,在给药后1周,由于神经组织中抗细胞凋亡,神经保护作用可以迅速地使大鼠恢复行走能力。此外,与人工脑脊液组相比,GM1组中TUNEL阳性细胞的数量明显地减少了。和人工脑脊液对照组相比,空白水凝胶组的运动功能的恢复也有所体现,但是两组数据并没有明显的不同。总的来说,组织学数据证实了功能恢复的结构,显示出GM1-水凝胶能够显著地提高了脊髓损伤动物的预后。（3）免疫组化研究的结果显示,脊髓损伤后第28天,相比于aCSF组、水凝胶组和GM1组,GM1-水凝胶组的GFAP强度有显著的降低。此外,与aCSF组相比,空白水凝胶组的GFAP强度要更低,虽然并没有发现明显的差别。同时,与aCSF组、水凝胶组和GM1组相比,轴突标记物NF200在GM1水凝胶组的表达明显地增加了。与aCSF组相比,NF200-阳性神经纤维的数量在空白水凝胶组中明显更高。结论:1)包裹着GM1的泊洛沙姆温敏型水凝胶在常温下为液态,当注射至大鼠脊髓损伤部位时,可快速转变为半固体形态,并能持续缓慢释放GM1药物,长达1个月。2)温敏型GM1-水凝胶能有效保护神经元,减少胶质疤痕形成,促进神经纤维再生,促进脊髓损伤后运动功能的恢复。-3)与传统给药方式相比,温敏型GM1-水凝胶可减少用药量和用药次数,减少药物副反应,且能起到更好的治疗效果。