胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖中的一项重要技术。自1983年首次报道冷冻胚胎移植（frozen embryo transfer,FET）临床妊娠以来,胚胎冷冻已成为人类辅助生殖领域中常见的技术手段。二次冷冻是指对解冻复苏后的胚胎进行再次冷冻。1990年,首例二次冷冻的胚胎成功妊娠。临床中,胚胎二次冷冻主要发生在以下几种情况:（1）随着单胚胎移植的逐渐普及,解冻胚胎数有时会多于移植胚胎数,对解冻移植后剩余的优质胚胎会进行二次冷冻;（2）8-细胞期的胚胎解冻后进行囊胚培养,但患者由于内膜等因素取消了移植周期,获得的可移植囊胚进行二次冷冻;（3）因各种原因,胚胎解冻复苏后不能移植。（4）对植入前遗传学检测（Preimplantation genetic testing,PGT）无结果的囊胚,解冻再次活检后需二次玻璃化冷冻。因此,通过二次冷冻,可以有效提高累计活产率,并降低多胎妊娠的风险。但是关于二次玻璃化冷冻人类胚胎的FET数据有限,而且大多数是病例报告,目前还没有关于不同发育阶段的二次玻璃化冷冻对临床结果影响的数据。本研究首先对重庆市妇幼保健院生殖医学中心在2015年1月至2019年12月间所有的FET周期中使用二次玻璃化冷冻的数据进行回顾性分析。通过数据统计,我们发现人类胚龄5天的胚胎在玻璃化冷冻解冻后,临床妊娠率和分娩率均显著降低。为了进一步探究其原因,我们以小鼠为研究对象,在小鼠胚胎的不同发育阶段进行玻璃化冷冻,来模拟人类胚胎的可能表型。结果显示,小鼠胚胎在8-细胞期二次玻璃化冷冻对其发育潜能没有影响,而囊胚期二次玻璃化冷冻后,胚胎植入率及出生率都显著降低,这与人类胚胎的统计结果一致,预示着在囊胚期二次玻璃化冷冻可能会对胚胎发育潜能产生一定的负面影响。囊胚期的谱系分化受到组蛋白表观修饰、多能性、细胞凋亡等多方面的调控。囊胚期免疫荧光染色及荧光密度分析发现,一次玻璃化冷冻及8-细胞期二次玻璃化冷冻对囊胚期激活型组蛋白H3K4me3修饰水平没有显著影响,而在囊胚期二次玻璃化冷冻会使组蛋白H3第四位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）修饰显著下降。此外,不论是一次还是二次玻璃化冷冻均会使囊胚期组蛋白H3第九位赖氨酸二甲基化（H3K9me2）及组蛋白H3第九位赖氨酸乙酰化（H3K9ac）修饰上调,但是在囊胚期的二次玻璃化冷冻H3K9ac上升尤为严重。这表明二次玻璃化冷冻可能会在全基因组水平抑制基因的表达。此外我们发现,除了组蛋白表观修饰,转录组也会受到玻璃化冷冻的影响。我们对不同阶段玻璃化冷冻的胚胎,通过RT-PCR对凋亡基因Bax、Caspas3及Bcl2,多能性相关基因Oct4、Sox2和Cdx2的表达进行了检测。结果显示,一次和二次玻璃化冷冻均会使Bcl2表达水平升高,Bax表达水平在二次玻璃化冷冻后显著上调,而Caspas3的表达水平只在囊胚期二次玻璃化冷冻后显著升高。多能性基因的表达水平也只在囊胚期二次玻璃化冷冻后有明显差异,Oct4水平下调、Sox2及Cdx2水平上调,这可能与囊胚期二次玻璃化冷冻后发育潜力降低有关。因此,我们推测第一轮低温保存所造成的损伤可能会在随后的发育过程中得到自我纠正,特别是在桑椹胚期,而在桑椹胚胚期之后,再次玻璃化冷冻会降低胚胎的发育潜能。综上,我们的研究表明,在8-细胞期和囊胚期的二次玻璃化冷冻对人类胚胎发育潜能有不同的影响,囊胚期二次冷冻影响更大。小鼠实验也证实了这些临床结果。因此,我们强调有必要在可能的情况下避免在8-细胞期玻璃化冷冻后在囊胚期的再次玻璃化冷冻,如果有需求,8-细胞期进行二次玻璃化冷冻可能会是更好的选择。