高产纤维素酶菌株筛选、诱变选育及其秸秆降解效果研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lianxingjiehaha
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木质纤维素是利用太阳能和光合作用所形成的二氧化碳的主要产品,是地球上最宝贵的可再生资源,然而现如今纤维素废弃物的处理仍然是一个巨大的挑战。目前,大多数纤维素物质(如玉米秸秆)都是通过就地焚烧来处理的,这不仅污染空气质量、损害人体健康,还导致了对生物质资源的大量浪费。所以开发有效处理和利用纤维素废弃物成为高质量碳源的方法已成为关键性的研究目标,而通过纤维素酶将木质纤维素降解为生物燃料是大规模利用木质纤维素的最有效方法之一。因此,本研究采用传统的培养方法,从自然界中筛选能够高产纤维素酶的降解微生物菌种,再通过常压室温等离子体(ARTP)诱变选育高产突变菌,优化培养工艺使其达到最优产酶状态,并分析优化后发酵条件下的秸秆降解效果,为获得高效纤维素酶资源提供实验基础和理论依据。从富含腐殖质的土壤中通过分离纯化,刚果红染色初筛出24株具有纤维素降解能力的菌株,并对菌株进行CMC酶活和FPA酶活测定,最终得到1株酶活力较高的菌株Ax4,其CMC酶活为36.01 U/mL,FPA酶活为22.70 U/mL,经形态学和分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并命名为Bacillus subtilis Ax4。为提高Bacillus subtilis Ax4产纤维素酶的能力,采用ARTP技术对其进行诱变育种,经过刚果红初筛、酶活复筛,选育出一株CMC酶活为71.89 U/mL的突变菌株T-26,较初始菌株Ax4提高了98%,其FPA酶活也提高了43.15%,该菌株经过连续6代培养,其发酵液的纤维素酶活力较第一代菌株保留85%以上,能够稳定遗传。为提高突变菌株T-26的产酶能力,采用响应面法优化其发酵工艺。以突变菌株T-26为出发菌,通过单因素实验优化,探究出最优发酵产酶条件为:培养温度30℃、接种量6%、发酵时间96 h,在此基础上进行PB设计分析影响产酶的显著因素,研究表明玉米淀粉、酵母粉、初始pH值为显著影响因素,并利用响应面优化确定菌株最佳产酶工艺为玉米淀粉2.59%,酵母粉1.63%,初始pH值5.22,优化后T-26的CMC酶活达到了118.90 U/mL,比优化前酶活提高了65.39%。对优化后的突变菌株T-26进行30 d的玉米秸秆降解效果研究。结果显示,菌株T-26在整个发酵过程中,pH值无大幅度变化,一直保持弱酸偏中性环境,说明具有一定的自我调节能力来维持生存环境的稳态,该菌株在发酵第18 d时,OD540值较大为0.761,此时CMC酶活和FPA酶活均达到最高,分别为111.09 U/mL和58.69 U/mL,结果表明菌株数目的多少对产酶有一定的影响。在30 d时,该菌株玉米秸秆失重率达到了56.31%,并使玉米秸秆组织造成一定的损坏,说明突变菌株T-26具有较高的降解秸秆能力。
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