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1目的声敏纳米脂质体(Sound sensitive liposomes)是一种新型药物载体,可以运载药物至特定组织及器官,并在局部超声波刺激下释放药物,从而达到靶向快速释药的目的,进一步提高靶向性及局部给药浓度。高强度聚焦超声(HIFU)是一种肿瘤热疗技术,通过对肿瘤局部实施高强度的定位聚焦超声而产生以瞬间高温为主的多重杀伤效应,从而杀灭肿瘤细胞[1]。但由于HIFU的高度定位特性,使实体瘤周边的肿瘤细胞无法有效杀伤。纳米脂质体颗粒还可作为HIFU增敏剂,能有效降低HIFU消融所需的强度阈值,并极大地增强肿瘤治疗的效果[2]。磁性普通纳米脂质体作为一种磁导向新型药物传递系统,可利用外加磁场的引导来改变药物在体内的分布,提高其治疗部位的药物浓度,并降低其他非治疗部位的药物浓度,达到靶向治疗的效果[3]。将二者联合应用于肿瘤的治疗,可达到协同杀伤肿瘤细胞的效果。本研究在前期工作基础上[4],选择声敏剂二氢卟吩e6(Ce6)为药物,采用蛋黄卵磷脂(EPC)与胆固醇作为声敏脂质体的膜材,通过正交试验进行处方工艺的优化,同时加入油酸改性纳米四氧化三铁,制成Ce6磁性声敏纳米脂质体(声敏脂质体),进行质量检查并评价其靶向性、声敏特性及细胞毒性等相关指标,为进一步采用微透析技术进行肿瘤局部药物动力学及PK-PD结合模型研究提供剂型支持。2方法2.1运用紫外分光光度法进行Ce6的含量检测,并进行方法学考察。2.2选择适当的制备方法和材料制备磁性声敏脂质体,并通过正交试验,优化处方工艺,对制备得到的Ce6磁性声敏纳米脂质体进行包封率、载药量、粒径形态、磁靶向性和声敏特性的评价。2.3由于Ce6对人肺腺癌和人乳腺癌具有较好的治疗作用,因此分别以人肺腺癌SPC-A-1细胞株和人乳腺癌MDA-MB-231细胞株为考察对象,试验中分为单纯细胞组、单纯超声组、二氢卟吩e6组,空白脂质体组,单纯脂质体1(普通脂质体:Ce6磁性普通纳米脂质体),单纯脂质体2(声敏脂质体:Ce6磁性声敏纳米脂质体),声动力治疗组(Ce6溶液+超声治疗),声动力治疗组1(普通脂质体+超声治疗),声动力治疗组2(声敏脂质体+超声治疗),采用MTT比色法,考察在不同的超声参数下,Ce6磁性声敏纳米脂质体对肿瘤细胞的抑制情况,计算抑制率,并与普通脂质体及未超声时进行比较。考察以上两者的抗肿瘤活性以及各组不同浓度水平的抗肿瘤情况。3结果3.1根据药物性质,建立了紫外分光光度计分析方法,并进行方法学考察。结果表明,其线性范围及精密度、稳定性、回收率等均符合实验要求。3.2通过对制备方法和制备材料进行筛选,本实验选择EPC和胆固醇为载体材料,按照薄膜分散-真空冷冻干燥技术制备,通过正交试验进行筛选、优化。3.3确定了制备工艺条件为有机相三氯甲烷,水化介质水,水化时间60min,水化温度50℃。优选的配方工艺条件为药脂比1:50,卵磷脂-胆固醇(5:1),tween-80用量0.5%,药磁比1:2。制备的Ce6磁性声敏纳米脂质体透射电镜下呈球形粒子分布,其外观圆整、大小均一,平均包封率90.28%,渗漏率3.28%,粒径176.9nm。3.4未经超声时,对比游离Ce6溶液,Ce6磁性声敏纳米脂质体的体外释放度表现出一定的缓释效果。当采用超声天使治疗仪,固定超声频率1.0MHz,与Ce6磁性普通脂质体相比,随着超声时间(0～150s)和超声强度(0～2.0W/cm2)的增加,Ce6磁性声敏纳米脂质体的体外累积释放度也随之增大,表现出良好的体外声敏特性。3.5实验发现对于两种肿瘤细胞,声动力治疗组2相对于其他组药物都显示出了更好的抑制效果。声敏脂质体的药物浓度分别在2.5～7.5μg/mL及2.5～1Oμg/mL,未经声动力治疗时,对SPC-A-1及MDA-MB-231肿瘤细胞均呈抑制作用。对于SPC-A-1肿瘤细胞,固定超声频率1.0MHz,当超声时间60s,超声强度为0.5W/cm2,声动力治疗组2对其抑制率随着声敏脂质体药物浓度的增加(2.5～7.5μg/mL)而增加;当超声强度为0.5W/cm2时,声动力治疗组2(2.5～7.5μg/mL)的抑制率随着超声时间(30～120s)的增加而有所升高(P<0.05);当超声时间为60s时,声动力治疗组2(2.5～μg/mL)的抑制率随着超声强度(0.5～2.0 W/cm2)的增加而显著提高(P<0.05)。另外,对于MDA-MB-231肿瘤细胞,固定超声频率1.0MHz,当超声时间60s,超声强度为1.0W/cm2,声动力治疗组2对其抑制率随着声敏脂质体药物浓度的增加(2.5～10μg/mL)而增加;当超声强度为1.0 W/cm2时,声动力治疗组2(2.5～10μg/mL)的抑制率随着超声时间(30～120s)的增加而有所升高(P<0.05);当超声时间为60s时,声动力治疗组(2.5～10μg/mL)的抑制率随着超声强度(0.5～2.0W/ccm2)的增加而显著提高(P<0.05)。4结论4.1薄膜分散-真空冷冻干燥技术适用于Ce6磁性声敏纳米脂质体的制备。以蛋黄卵磷脂作为声敏脂质体的制备材料,包封率为指标,通过正交试验进行影响因素筛选,可以制得声敏性良好的脂质体。4.2用油酸进行磁性Fe304表面的改性,有利于提高磁粉的亲油性,使磁粉与脂质体表面的结合更容易,形成的稳定磁性脂质体混悬体系,在外加磁场的引导下,能够聚集在肿瘤部位。4.3研究Ce6磁性声敏纳米脂质体的细胞毒性试验,利用超声天使治疗仪装置,在设定的浓度范围内,经过不同超声时间(0～150s)和超声强度(0～2.0 W/cm2)作用下,声动力组2相比其他实验组对人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞和人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞抑制率都有所提高,并且在相同超声参数处理下,Ce6磁性声敏纳米脂质体对SPC-A-1肿瘤细胞的抑制率大于MDA-MA-231肿瘤细胞(P<0.05)。