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[目的]通过检测Wnt通路抑制剂和不同水平钙对氟中毒小鼠成骨细胞增殖过程中Wnt信号通路相关基因和蛋白表达水平的变化,探究氟致小鼠成骨细胞增殖的作用机理以及适当剂量的钙对氟中毒的缓解作用,为有效防治氟中毒提供理论依据。[方法]取出生24h内的小鼠颅骨,采用阶段性酶消化法分离纯化培养细胞,经HE、吉姆萨、碱性磷酸酶和钙化结节染色鉴定为成骨细胞后,进行成骨细胞的传代,取第三代生长状况良好的小鼠成骨细胞随机分为7组。每组进行如下处理：对照组(C)用正常DMEM完全培养液培养,攻氟组(F)分别添加10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的氟化钠,氟加抑制剂组(F+Y)添加10-6mol/L的氟化钠和5μg/mL的Wnt通路抑制剂DKK1,抑制剂组(Y)添加5μg/mL的DKK1,氟加低钙组(F+Cal)在攻氟组培养液中添加1mmol/L的氯化钙,氟加中钙组(F+Call)在攻氟组培养液中添加2mmol/L的氯化钙,氟加高钙组(F+Calll)在攻氟组培养液中添加4mmol/L的氯化钙。试验周期为24h。使用MTT法检测成骨细胞增殖情况,使用real-time PCR技术检测成骨细胞Wnt信号通路相关基因的表达水平,使用细胞免疫荧光、激光共聚焦、Western blotting技术检测成骨细胞Wnt信号通路相关蛋白的表达水平。[结果]1.本试验采用酶消化法成功从小鼠颅骨中分离出细胞并培养,利用HE、吉姆萨、碱性磷酸酶、茜素红多种染色法鉴定所培养细胞为成骨细胞。2.10-8、10-7、10-6mol/L的氟对小鼠成骨细胞增殖有显著促进作用,10-5mol/L的氟对小鼠成骨细胞增殖的促进作用不显著,10-4mol/L的氟对小鼠成骨细胞增殖有抑制作用。3.体外培养小鼠成骨细胞24h时,氟对其增殖率影响最显著。4.Wnt通路抑制剂明显抑制了氟致小鼠成骨细胞的增殖。5.10-6mol/L的氟能够促进小鼠成骨细胞中Wnt3a、β-Catenin、C-myc基因mRNA水平的表达,添加2mmol/L的钙有效抑制了氟致小鼠成骨细胞增殖相关基因的表达。6.10-6mol/L的氟能够促进小鼠成骨细胞中β-Catenin、Wnt3a、C-myc和CyclinD1蛋白的表达,抑制GSK3β蛋白的表达,添加2mmol/L的钙有效抑制了氟致小鼠成骨细胞增殖相关蛋白的表达。[结论]10-6mol/L的氟通过激活Wnt信号通路促进小鼠成骨细胞增殖,补充2mmol/L的钙能有效缓解氟对成骨细胞的毒性作用。