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真核生物染色质装配因子1(chromatinassemblyfactor1,CAF-1)是染色质装配过程中重要的组蛋白分子伴侣,在进化中高度保守。黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)dCAF-1-p55是果蝇中CAF-1复合物的最小亚基,它与另外两个亚基dCAF-1-p180和dCAF-1-p105一起负责将新合成的组蛋白H3/H4装配到新复制的DNA上。除CAF-1复合物之外,dCAF-1-p55还参与其它多个复合物的形成,如NURF(NucleosomeRemodelingFacotor),PRC2(Polycomb-RepressiveComplex2)及Sin3-HDACl(Sin3-histonedeacetylase1)。dCAF-1-p55的这一广泛参与性提示其功能的多样性和重要性。
为研究dCAF-1-p55在体内的生物学功能,我们利用靶向基因敲除技术(genetargeting)制备了果蝇dCAF-1-p55突变体。实验结果表明,dCAF-1-p55的缺失导致果蝇发育迟缓且在幼虫期致死,表达UAS-dCAF-1-p55转基因可以挽回致死表型。在眼睛中特异敲低dCAF-1-p55,导致成体果蝇眼睛变小、小眼排列紊乱、刚毛缺失;在翅膀的posterior区特异敲低dCAF-1-p55,导致posterior区变小、脉络缺失、缺刻等表型。全突变体细胞克隆分析显示:成蝇眼睛与翅膀中dCAF-1-p55突变体克隆的表型与敲低基因表达导致的表型类似。LOF(lossoffunction)分析结果提示dCAF-1-p55在果蝇发育过程中的功能可能与细胞增殖及细胞分化的调控相关。这篇论文我们主要阐述它在调节细胞增殖过程中的作用。
BrdU掺入实验结合免疫荧光染色结果显示:dCAF-1-p55突变体克隆中BrdU掺入增强、磷酸化组蛋白H3(pH3)的水平增加,说明dCAF-1-p55的功能缺失同时导致S期和M期细胞数量增加;同时,我们对果蝇脑中成神经细胞(neuroblasts)的观察发现,在dCAF-1-p55突变体细胞中,有丝分裂中期染色体结构较为松散、姐妹染色单体连接异常,后期染色体不能正常分离。值得注意的是,在dCAF-1-p55敲低的组织中,显示细胞凋亡发生的Caspase3信号明显增多。这些数据说明:dCAF-1-p55的功能缺失导致的S期和M期细胞异常增多并不会最终导致组织过度增殖,相反这些异常增多的M期和S期细胞可能不能完成正常细胞分裂周期,而是最终走向了凋亡。这可能也是dCAF-1-p55突变造成组织变小的主要原因。
为了进一步探索CAF-1-p55突变如何引起细胞周期改变,我们首先选用翅成虫盘细胞进行FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)分析。与对照相比,敲低dCAF-1-p55导致S期细胞增加了9％,而处于G1期的细胞则降低了9％,提示dCAF-1-p55可能参与细胞周期的G1/S转换调控。CyclinE是G1/S转换重要调节因子,因此我们检测了dCAF-1-p55缺失细胞中CyclinE水平。结果表明,dCAF-1-p55缺失细胞中的CyclinE在转录和蛋白水平都显著上调,提示dCAF-l-p55对细胞周期的调节作用可能是通过改变CyclinE水平实现的。RBF/E2F是CyclinE的重要调节因子。遗传学分析表明,在dCAF-1-p55缺失组织中过量表达UAS-rbf下调dDP(E2F的partner)均能很好地挽回DNA复制增强的表型。这些数据提示,dCAF-1-p55可能是通过RBF/E2F通路调节CyclinE,进而控制细胞周期的正常运转。