获得性癫痫是常见的癫痫类型,通常起源于已知的神经系统损害。神经系统损害可诱导神经元产生一系列短期或长期的可塑性改变,最终产生自发性反复痫性发作。这些可塑性改变被认为重新构筑了神经系统的兴奋性网络,导致大脑的兴奋性增高。目前已知多种离子通道参与了可塑性改变过程,其中包括电压门控型钾通道(Kv)。它是大脑电信号重要的调节因子,钾通道的改变可能导致神经元高兴奋性,成为癫痫发生的重要原因。近年来,A型钾通道引起广泛关注,因为它具有控制后传播动作电位和动作电位发放频率的作用。Kv4.2是大脑海马、皮层最重要的A型钾通道。很多证据显示Kv4.2是神经元兴奋性的重要调节分子,并在不同类型的人类癫痫或癫痫动物模型发现Kv4.2的异常。然而,关于Kv4.2在癫痫发生发展中的可塑性变化及其调控机制未见相关报道。近年发现钾通道相互作用蛋白(KChIPs)可直接调节Kv4.2的表达水平和电化学属性。KChIPs可与钙离子结合,将细胞内钙信号通过调节Kv4转化为神经元膜兴奋性改变。研究发现KChIP1在大脑分布广泛,能与Kv4.2结合,但未见有关KChIP1的详细分布、定位的报道。在本研究中,我们首先探讨KChIP1在大脑中的分布特征,了解KChIP1与GABA能神经元、Kv4.2的定位关系。更重要的是,为了探讨A型钾通道在癫痫发生发展中的可能作用,本研究应用氯化锂-匹罗卡品诱导的获得性癫痫模型研究KChIP1与Kv4.2在癫痫发生发展过程中的动态变化,并了解癫痫持续状态后的细胞内钙稳态。方法选用成年健康雌性SD大鼠按常规方法进行免疫组织化学反应、DAB染色观察KChIP1在脑中的分布。用免疫荧光双标法研究KChIP1与GABA、Kv4.2的共定位,在共聚焦显微镜下扫描,观察二者分布与细胞亚定位的相关性和差异性。制作氯化锂-匹罗卡品癫痫模型,分别用免疫组化和Western blot方法研究癫痫持续状态后KChIP1与Kv4.2的分布与动态变化。分别用灰度分析与细胞计数的方法研究获得性癫痫发生发展过程中Kv4.2、KChIP1的表达水平。在癫痫持续状态后24小时,制作急性脑片,用Fluo-3 AM钙离子染料标记细胞内游离钙,研究病理与生理状态下钾离子通道阻滞剂4-AP诱导的细胞内钙离子浓度的变化。本试验所得数据用t检验,p<0.05为有显著差异。结果在大鼠大脑中可见KChIP1广泛分布于大脑皮质、丘脑、海马、小脑等结构。KChIP1的分布具有明显的区域特征。在海马和大脑皮质,KChIP1(大约60%)主要表达在GABA能中间神经元,并主要表达在神经元的胞体和近端树突。研究还发现,KChIP1与Kv4.2存在着共定位,但在海马的亚细胞定位具有一定差异性,Kv4.2主要分布在锥体神经元的远端树突,在近端树突和胞体膜上也有一定的分布。氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫持续状态后可见海马出现明显的细胞丢失,尤其在CA1区。免疫组化研究发现癫痫持续状态后海马与皮层的Kv4.2与KChIP1表达增加,在CA1与CA3区尤为明显。但在获得性癫痫的慢性发作期在CA1区、CA3区发现Kv4.2与KChIP1表达下降。癫痫持续状态后对Kv4.2与KChIP1的表达水平动态分析结果显示Kv4.2在癫痫发作后6~48小时有统计学意义的升高。KChIP1在癫痫发作后3~24小时具有统计学意义的升高,48小时后降至正常水平。KChIP1的峰值时间早于Kv4.2。与海马相比,皮层KChIP1与Kv4.2的总体表达水平较高。在癫痫发作后,皮层Kv4.2与KChIP1表达水平轻度升高,但仅Kv4.2在24小时的升高有统计学意义,显示皮层KChIP1与Kv4.2可塑性变化不及海马明显。在癫痫持续状态后24小时制作急性脑片,研究海马CA1区锥体神经元细胞内游离钙浓度,结果显示静息状态下未发现癫痫持续状态后的神经元细胞内钙离子浓度增高。但在用4-AP诱导的细胞内钙瞬变发现,癫痫持续状态后神经元细胞内钙上升峰值增高、恢复时间延长。结论1、A型钾通道的主要调控蛋白KChIP1在大鼠脑中分布广泛,在神经细胞胞体、树突、细胞膜均有分布;KChIP1主要表达在GABA能神经元,与Kv4.2也有较高的共定位。2、氯化锂-匹罗卡品诱导的获得性癫痫模型潜伏期,皮层、海马Kv4.2表达水平短暂增高,可能是一种对神经元过度兴奋的代偿性自我保护反应。3、获得性癫痫模型潜伏期海马KChIP1表达水平短暂增高,表达改变的时间较Kv4.2提前,提示了KChIP1可能参与了癫痫发生发展过程中的兴奋性调节机制,并可能参与了Kv4.2的上调机制。4、癫痫持续状态后4-AP诱导的钙瞬变峰值增加、恢复时间延长,反映了癫痫发展期细胞内钙稳态的紊乱,并可能与A型钾通道的表达上调有关。5、海马CA1、CA3区Kv4.2与KChIP1在获得性癫痫模型慢性发作期表达减少,提示树突型A型钾通道功能下降可能是局部神经元环路兴奋性增加的一个重要机制,最终导致癫痫的自发性发作。