论文部分内容阅读
细菌的趋化性(chemotaxis)是细菌响应环境化学物质梯度的移动，是细胞对碳源、能源竞争的一种表现。趋化性可以提高污染化合物的生物可降解性，有效地促进降解性细菌对污染物的原位生物修复作用。本实验室刘智博士从长期施用甲基对硫磷(MP)的污染土壤中分离得到一株能以甲基对硫磷为唯一碳源生长并能矿化MP的降解菌Pseudomonas putida DLL-1，通过游动平板法发现该菌株对MP表现出很强的趋化性，在合适的农药浓度下，随着农药浓度的增加，趋化能力也增强。本文研究出一种新的趋化验证方法——梯度游动平板法，不仅能像普通的游动平板分析法一样，通过肉眼观察到菌体在趋化平板上的游动痕迹，即趋化圈，而且可以在不同浓度梯度趋化物平板上更明显的观察出菌体由低浓度向高浓度游动的迹象。为研究菌株DLL-1趋化性和降解性之间的关系并获得趋化性状丧失的突变株，从菌株DLL-1中通过设计特异性引物克隆出编码组氨酸激酶的基因cheA，通过同源重组打靶的方法在其内部插入一卡那霉素抗性基因(Km)使其失活，成功地得到趋化性能丧失菌株DAK。验证了外源基因片段的插入对菌株生长没有显著影响的情况下，采用土壤盆钵试验验证原位条件下突变株DAK与野生株DLL-1对MP的降解效率，结果发现在低浓度(50mg／kg)MP条件下，突变株DAK在36h对MP的降解比野生菌株DLL-1低约20％～30％，从而更进一步得说明趋化性与降解性密切相关，细菌的趋化性在农药的原位降解中具有重要作用。采用转座子标签法获得了2株丧失趋化功能的插入突变株A3-27、a4-8。突变株能降解MP，仍保留MP水解酶活性，为单一趋化性状丢失。通过生长能力测定，发现这两突变株的插入突变只有其中一株A3-27的生长受到影响，在无机盐培养基中添加葡萄糖和MP作为碳源不生长。通过土壤中对MP的原位降解试验的比较，发现两株趋化突变株其降解性能显著低于野生菌株DLL-1，A3-27的降解能力由于其生长情况受到抑制，且其降解能力比野生菌株低约60％，突变株a4-8生长没有受到影响，其趋化性状的丧失使其降解性能比野生菌株低约40％。为了克隆趋化基因及其相关基因，根据插入转座子Tn5已知序列设计引物，分别以突变株基因组DNA为模板向转座子上游(5’端)和下游(3’端)进行SEFA-PCR扩增，扩增产物经T-A克隆测序、拼接后在NCBI上进行BLAST比对。结果显示趋化突变株A3-27被失活的基因为编码3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶的一个基因(LeuB)，该基因的突变导致该菌株成为亮氨酸营养缺陷型，进而解释了为什么菌株会在基础盐培养基上不生长的现象。突变株a4-8被失活的基因为鞭毛蛋白编码基因fliC，鞭毛在趋化运动过程中起着关键作用，鞭毛蛋白FliC的失活使得鞭毛不运动，导致了趋化性的丧失。菌株的不生长和不游动性，在原位条件下对外源农药趋化物利用优势降低，因此降解能力也随之减弱，趋化相关基因的获得为细菌的趋化性和降解性的关系研究提供了理论依据。为了研究P．putida DLL-1的趋化性是否受MP降解产物对硝基苯酚(PNP)的诱导，本章试图通过同源重组打靶的方法将编码甲基对硫磷水解酶基因mpd失活。成功构建了一个mpd基因内部插入Km抗性基因片段的同源重组打靶载体，在同源重组过程中，发现mpd基因的突变并没有让菌株丧失水解MP的能力，因此怀疑mpd在整个染色体上可能不是单拷贝的，也有可能外源片段Km插入的位点没有影响到mpd基因在染色体上的表达，这一现象值得进一步深入研究。