肺癌是目前全世界具有较高发病率和死亡率,对人类健康和生命具有重大威胁的恶性肿瘤之一,包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)。临床结果表明NSCLC占所有肺癌病例80%以上,其早期症状不明显,一经诊断往往进入中晚期,5年生存率较低。目前针对中晚期NSCLC的治疗,顺铂(cisplatin,DDP)是主要化疗手段,但不同分化状态的肿瘤细胞对DDP的敏感性差异很大。临床研究表明低分化NSCLC肺腺癌相对于高分化肺腺癌具有更强的耐药性,是导致临床低分化肺腺癌治疗效果差、肿瘤易复发与转移的重要原因,但病理机制不详。因此,探索低分化NSCLC肺腺癌耐药机制对提高药物治疗效果、改善患者生存质量、发现抗肺癌治疗新策略、研发抗肺癌新药物具有极其重要的意义。本文综合临床肿瘤病理、生物化学、分子药理学等多个学科的研究方法与手段,发现参与调控低分化NSCLC肺腺癌多药耐药的关键基因GCN2与调节肿瘤干性的关键基因RCD91,为低分化NSCLC肺腺癌治疗提供了新理论依据与治疗策略。1:GCN2调节低分化NSCLC对铂类药物敏感性在NSCLC肺腺癌临床标本中,发现eIF2α激酶GCN2蛋白表达水平与NSCLC腺癌的临床分化程度呈负相关,低分化肺腺癌高表达GCN2,耐受DDP诱导的细胞凋亡,抑制低分化肺腺癌GCN2-蛋白质表达水平可显著增强它们对DDP的凋亡敏感性,表明GCN2是影响肺腺癌低分化肺腺癌细胞对DDP耐药性的关键蛋白质。进一步研究表明GCN2可以通过转录因子CHOP激活P-gp、MRP-1、MRP-2等与耐药相关基因的转录。有趣的是,虽然GCN2蛋白质表达水平决定肺腺癌细胞对DDP的敏感性,但在DDP敏感的肺腺癌细胞中,DDP自身能促进β-arrestins与NEDD4L介导的GCN2泛素化降解;但在DDP耐受的肺腺癌细胞中,GCN2泛素化降解作用受抑,其原因在于GCN2第899位苏氨酸磷酸化在DDP耐受NSCLC细胞中增强,而磷酸化的GCN2抑制β-arrestins/NEDD4L/GCN2降解复合物形成,进而抑制GCN2泛素化降解。进一步研究发现GCN2第899位苏氨酸磷酸化在低分化肺腺癌中高表达。通过小分子GCN2磷酸化激活剂和抑制剂进行干预发现,激活高分化肺腺癌中GCN2第899位苏氨酸磷酸化能够增强DDP耐受性,减少DDP进入肿瘤细胞发挥作用;而抑制DDP耐受细胞中GCN2第899位苏氨酸的磷酸化可以逆转其DDP耐受性,促进DDP的细胞摄入。因此,GCN2磷酸化水平是影响NSCLC对DDP是否敏感的重要生物学机制,GCN2磷酸化通过激活CHOP/MDR抑制DDP进入细胞内发挥作用,抑制GCN2磷酸化能逆转低分化NSCLC腺癌对DDP的耐受性。本论文首次阐述了 GCN2在调节低分化非小细胞肺腺癌对DDP耐受的重要作用。2:RCD91调节低分化非小细胞肺腺癌的肿瘤干性与顺铂耐药性肿瘤中存在一类具有自我增殖、修复与分化潜能的“干性”细胞,称之为肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞,这群“干性”细胞是肿瘤耐药与肿瘤复发转移的“罪魁祸首”。因此,深入探索“干性”肿瘤细胞生物学机制,寻找调控肿瘤“干性”的相关基因,对逆转“干性”肿瘤细胞的耐药性,抑制肿瘤的复发恶化具有重要意义。本研究发现一种RNA结合蛋白RCD91在低分化NSCLC肺腺癌中低表达,而在高分化NSCLC腺癌中高表达,干扰RCD91表达能促进肺腺癌异植瘤的生长,由此推测RCD91可能是一个抑癌基因。为探索其生物学机制,发现在NSCLC中,RCD91的表达与肿瘤干性标志物CD133表达、肿瘤干细胞成球率、成瘤率与侧群细胞比例等呈负相关,而过表达RCD91能抑制肿瘤干性,逆转NSCLC对顺铂耐药性,因此RCD91是NSCLC肿瘤干性负调控蛋白。文献表明β-catenin/WNT通路的激活参与了 NSCLC中肿瘤干细胞功能的维持与耐药性,本研究发现RCD91通过RRM3 domain与CTNNB1上面的TCF4结合域结合,抑制WNT通路的激活,并抑制下游TCF4靶基因如CCND1和survivin的转录,从而抑制WNT通路介导的肿瘤干性和耐药性。有趣的是,RCD91通过β-catenin/WNT通路抑制c-Myc表达,而反过来c-Myc与转录因子Sp1协同负调控RCD91 mRNA的转录,从而形成RCD91-c-Myc反馈性调节环路,精密调控低分化NSCLC肺腺癌干性。基于RCD91在调节NSCLC腺癌干性中的重要性,本研究以RCD91转录为靶点建立了小分子筛药体系,发现白藜芦醇、槲皮素、大黄素、汉黄芩素以及c-Myc抑制剂JQ-1均能通过干预RCD91的表达,并在一定程度上抑制低分化NSCLC肺腺癌的肿瘤干性。因此,本研究发现RCD91在调控NSCLC腺癌干性中的新功能与生物学机制,表明RCD91是可供干预的逆转NSCLC肿瘤干性与顺铂耐药的靶基因。全文总结:顺铂是临床治疗中晚期NSCLC腺癌的一线药物,对延长患者存活时间,改善患者生存质量有积极治疗价值,但肿瘤细胞对顺铂耐药是肿瘤复发与转移的重要病理性机制,因此,有效逆转肿瘤耐药对攻克癌症有重大应用价值。本研究围绕低分化NSCLC肺腺癌对DDP耐药,发现GCN2磷酸化、RCD91表达在调节低分化NSCLC对顺铂耐药中新生物学机制,这些机制的阐明为纠正临床低分化NSCLC耐受DDP提供了丰富的理论依据,为开发能够逆转低分化肺腺癌对DDP耐受的治疗药物奠定基础。