前言颅内海绵状血管瘤(cerebral cavernous malformation,CCM)是中枢神经系统血管畸形的一种,约占中枢神经系统血管畸形的9%左右,人群发生率为0.45%-O.9%,作为神经外科常见的血管性疾病之一,有学者已对其进行了较深入的临床和基础研究,取得较大进展,但对其出血机制研究较少。由于在血流动力学上,CCM是一种低压、低流量的血管畸形,且没有主要的供血动脉,为何能有一个较高的反复出血的机制尚不清楚。出血虽大多属于亚临床型的微出血,有明显临床症状的出血相对较少,约为8%-37%,但文献报道既往有出血史者具有相对高的出血率,尤其是位于脑干及重要功能区的出血可引起神经功能缺失,甚至危及生命。本课题着眼于此拟通过对海绵状血管瘤的超微结构及免疫组化方面进行研究,深入探索CCM反复出血的发病机制,并对其原因给予推断,以期为临床治疗该疾病提供必要的理论依据。材料与方法一、一般资料收集中国医科大学附属盛京医院神经外科2002-2008年手术并经病理证实的CCM标本35例,包括额叶8例,枕叶6例,颞叶4例,基底节区2例,桥脑7例,小脑半球6例,蝶骨嵴外侧2例。其中男20例,女15例。年龄1-74岁,平均年龄30.91岁,病程自6h-20年不等;以癫痫起病者12例,出血17例,无症状6例(2例为常规体检,4例为脑外伤后头部摄片时偶然发现)。选择经病理证实的肝海绵状血管瘤35例及正常脑组织血管4例作为对照,正常脑组织标本来源于重度颅脑外伤行内外减压手术患者。标本取材征求家属同意及学校伦理委员会批准。二、实验方法(一)HE及免疫组化染色标本常规石蜡包埋、切片,行HE染色及免疫组织化学染色。实验严格按照免疫组织化学SABC法常规染色步骤进行。Ang-1及CD68一抗浓度为1:200,MMP-9一抗浓度为1:160,水浴加热25分钟,SABC试剂盒及其他实验试剂均购于武汉博士德公司,每次实验均设阴性及阳性对照。(二)透射电镜观察取新鲜组织切成米粒大小于2.5%戊二酸中固定,O.1MPBS(磷酸缓冲液)漂洗,1%锇酸固定,0.1MPBS(磷酸缓冲液)漂洗,酒精梯度脱水,EPON812(环氧树脂)浸透、包埋,超薄切片70nm,醋酸铀、柠檬酸铝染色,JEM-1200EX镜下观察,拍片。三、观察对照相应的普通病理学切片,观察免疫组化染色切片血管腔的内皮细胞层、内皮下层、海绵间隙基质及血管周围的组织学特点与免疫染色情况。由1位对病情不了解的病理科医生观察染色结果,根据1996年全国免疫组化技术与诊断标准,细胞浆和(或)细胞核呈棕黄色至深棕黄色为阳性细胞,按照同一部位血管染色强度,所有免疫组织化学染色结果与染色结果为AAA标本对照,染色结果被分为四级:在所有内皮细胞中染色为阴性或阳性结果少于25%记为(-),阳性结果位于25%-50%之间记为(+),50%-75%之间为(++),大于75%为(+++)。电镜下着重观察内皮基底膜,内皮细胞间隙等变化。统计学处理采用SPSS13.0软件包,组间比较采用秩和检验。结果1、光镜下海绵状血管瘤病灶主要由窦状扩张的共壁血管组成,血管腔大小不一,病灶内含有红细胞。CCM血管壁薄,仅有单层内皮细胞和较薄的外膜,缺乏肌层和弹力层,不含脑实质组织(图1)。肝海绵状血管瘤血管壁较厚,可见纤维组织及胶原组织(图2)。2、免疫组化染色Ang-1免疫阳性产物为棕黄色颗粒,主要分布于血管内皮细胞的包浆(图3、4),其在CCM中的表达较低,与对照组相比差异无显著性(P>0.05)(表2),CD68及MMP-9表达主要位于血管外膜细胞的包浆,产物同样为棕黄色或黄色颗粒(图5、6、7、8、9),其在CCM中表达显著增高,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)(表1)。CD68与MMP-9的表达之间行秩和相关分析结果r=0.870两者间呈高度正相关。3、电镜下CCM血管结构不完整,内皮细胞呈单层分布,核多规则,核内异染色质边集,细胞间可见明显的间隙连接,基底膜模糊显示不清,线粒体增多,血管周边大量电子密度高的沉积物。(图10),肝海绵状血管瘤与CCM明显不同的是细胞间连接紧密,基底膜清晰可见,但细胞核形态不规则(图11).结论颅内海绵状血管瘤的血管在结构和功能上的缺陷和不稳定,是其出血的前提条件,Ang-1、CD68及MMP-9与其出血密切相关。