蜕皮激素(Ecdysone,20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)协同调控昆虫的生长发育。其中,昆虫丝物质合成和分泌的过程也受到激素的调控。蜕皮激素通过由蜕皮激素受体(Ecdysone receptor,Ec R)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)组成的异源二聚体发挥作用。保幼激素(Juvenile hormone,JH)能特定结合到USP蛋白,引起受体分子构象改变,起到促进二聚化稳定受体二聚体的作用。家蚕是重要的产生丝物质的经济昆虫,但蜕皮激素和保幼激素协同调控家蚕丝蛋白基因表达的机制还不清楚。为了研究20E和JH对家蚕丝蛋白基因的表达调控,本实验通过实时定量PCR技术分别检测了激素处理后中部丝腺Ser-1基因及后部丝腺Fib-H、Fib-L和P25基因的表达水平;为了识别出丝蛋白基因启动子上的蜕皮激素响应元件(Ecdysone response element,Ec RE),通过等温量热滴定(Isothermal titration calorimetry,ITC)技术分别检测了纯化后的蜕皮激素受体和超气门蛋白(Ec R-B1D/USPD)结构域蛋白复合体与预测的家蚕丝蛋白基因Ec REs的相互作用,还对20E-Ec R-B1D/USPD-Ec RE调控模型做了进一步地分析。结果如下:1.体外条件下中部丝腺经激素处理后Ser-1基因的表达特征分析为了研究激素处理后Ser-1基因在中部丝腺的表达特征,本研究体外培养了家蚕五龄幼虫中部丝腺,在培养基中加以不同激素处理。研究发现,不同浓度的20E或JH处理后,Ser-1的表达均受到抑制;然而,20E和JH共同处理后,Ser-1的表达在72 h明显上调,这表明,20E和JH共同作用更有利于提高丝蛋白基因的表达。2.体外条件下后部丝腺经激素处理后Fib-H、Fib-L和P25基因的表达特征分析2.1激素对Fib-H基因表达的影响为了研究激素处理后Fib-H的表达变化,本研究体外培养了家蚕五龄幼虫后部丝腺,在培养基中加以不同激素处理。结果表明,不同浓度的20E或JH处理后,Fib-H的表达均受到抑制。20E和JH共同处理后,Fib-H的表达均在72 h显著提高。以20E处理24 h后转入含有20E和JH的培养基共同处理,或者以JH处理24 h后转入含有20E和JH的培养基共同处理,这两种处理对Fib-H表达的影响没有明显差异。2.2激素对Fib-L基因表达的影响为了研究激素处理后Fib-L的表达变化,本研究体外培养了家蚕五龄幼虫后部丝腺,在培养基中加以不同激素处理。结果表明,0.1μg/m L 20E对Fib-L的表达没有明显影响,0.5μg/m L和2.5μg/m L浓度的20E不同程度的促进了Fib-L的表达;不同浓度的JH对Fib-L的表达均有抑制作用。另外,研究发现,0.5μg/m L 20E和0.5 ng/m L JH共同处理对Fib-L的表达存在抑制作用,0.5μg/m L 20E和5 ng/m L JH处理组及0.1μg/m L 20E和5 ng/m L JH处理组促进了Fib-L的表达,并且后者的促进效果更明显,这表明20E和JH对Fib-L的调控有浓度依赖性;以20E处理24 h后转入含有20E和JH的培养基中培养促进了Fib-L的表达,然而以JH处理24 h后转入含有20E和JH的培养基中培养抑制了Fib-L的表达,这表明激素处理的先后对Fib-L的表达存在显著影响。2.3激素对P25表达的影响为了研究激素处理后P25的表达变化,本研究体外培养了家蚕五龄幼虫后部丝腺,在培养基中加以不同激素处理。结果表明,不同浓度的20E对P25的表达有促进作用,不同浓度的JH对P25基因的表达有抑制作用。另外,研究发现,0.5μg/m L 20E和0.5 ng/m L JH共同处理对P25的表达有抑制作用,而0.5μg/m L 20E和5 ng/m L JH处理组及0.1μg/m L 20E和5 ng/m L JH处理组促进了P25的表达,并且后者的促进效果更明显,这表明20E和JH对P25的调控有浓度依赖性;在以20E处理24 h后转入含有20E和JH的培养基中培养或者以JH处理24 h后转入含有20E和JH的培养基中对P25的表达没有明显差别,这表明激素处理先后对P25表达的影响没有明显差别。3.蜕皮激素受体结构域Ec R-B1D和超气门蛋白结构域USPD的共表达本研究克隆USPD基因片段并连接到p ET-28a载体上,转化E.coli BL21(DE3),然后用Ec R-p ET21b-MDX12重组质粒转化含有USP-p ET-28a(+)的E.coli BL21(DE3)感受态。IPTG诱导重组蛋白表达,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果。使用Ni-NTA亲和层析柱纯化,得到了Ec R-B1D/USPD蛋白复合物,纯度达到95%。4.Ec R-B1D/USPD与丝蛋白基因蜕皮激素响应元件(Ec REs)的结合反应在体外条件下通过ITC获得了Ec R-B1D/USPD蛋白与预测的家蚕丝蛋白基因Ec REs相互作用的一系列热力学参数包括亲和力常数(K)、反应热(ΔH)和熵(ΔS)。Ec R-B1D/USPD蛋白能够与预测的丝蛋白基因的Ec REs进行结合,结果表明,预测的序列TTTTC、TCTTT、ACTTT、TTTTC可能分别是Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1基因Ec RE的关键序列,并且该序列是保守的。5.20E与Ec R-B1D/USPD复合体及Ec RE的模型分析在体外条件下通过ITC研究发现,20E能与Ec R-B1D/USPD二聚体结合,Ec R-B1D/USPD二聚体能与Ec RE结合,20E-Ec R-B1D/USPD组成的复合体也能与Ec RE结合。这为20E通过Ec R-B1D/USPD诱导丝蛋白基因表达的这种模式提供了新的证据。本研究从转录水平上详细阐明了20E及JH对Ser-1、Fib-H、Fib-L和P25基因表达作用的基本规律。另外,通过ITC技术检测了Ec R-B1D/USPD蛋白与Ec REs结合情况,识别出丝蛋白基因的Ec REs。这项研究为丝蛋白的激素调控提供了重要的数据,也为增丝机理的研究提供新思路。