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软骨藻酸是由海洋硅藻中的拟菱形藻属产生的一种海洋生物毒素,被海洋生物(如贝类、蟹等)摄食后能够在其体内富集,人类若误食被污染的海产品,会造成腹泻呕吐、记忆丧失等症状,严重者甚至昏迷死亡,因此又被称作失去记忆性贝毒。软骨藻酸曾在加拿大引发过集体中毒事件,严重威胁人类身体健康。我国虽然未曾发生过此类中毒事件,但随着赤潮频发、有毒赤潮爆发次数的增多及国际水产的交易量日趋增大,海产品中的毒素检测问题不容忽视。软骨藻酸通常使用的检测方法包括小白鼠生物检测法、高效液相色谱-紫外检测法、免疫分析法等。小白鼠生物检测法因其不能达到各国对海产品中软骨藻酸含量限值(20μg/g)而逐步被各国淘汰,而高效液相色谱检测成本过高,不适合基层单位对大批量样品进行检测。免疫分析法检测限低,能迅速检测大量样本,已在农药兽药及医药上有广泛应用。然而我国在赤潮藻毒素免疫分析上,远远落后于国外,因此迫切需要在这方面建立起有自主知识产权的快速免疫分析法。本文采用活泼酯法将软骨藻酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,制备了相应的完全免疫抗原DA-KLH及包被抗原DA-BS,用紫外扫描验证偶联的成功与否。并设计了合适的免疫程序,用所合成的免疫抗原DA-KLH对新西兰白兔进行颈背部多点免疫。第三次免疫起,用间接ELISA方法测定血清中抗体含量。当抗体效价达到一定程度后,心脏取血,分离血清,经辛酸-硫酸铵两步法纯化后获得多克隆抗体,并验证了抗体的特异性。初步建立了软骨藻酸的间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测法:确定了包被抗原及抗体最佳工作浓度,最佳封闭液种类及封闭时间,最佳一抗二抗温育条件。最后用所建立ic-ELISA法及HPLC-UVD等两种方法对实际样品进行了检测与比较。具体结果与结论如下:1.采用活泼酯法,将软骨藻酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,制备了相应的完全免疫抗原DA-KLH及包被抗原DA-BSA,并通过紫外光谱扫描定性鉴定偶联成功。2.采用颈背部多点免疫法,经过9次共19周的免疫获得效价为1600的抗血清,纯化后得到效价为800的抗体。抗体与L-谷氨酸及D-天门冬氨酸无交叉反应率。3.建立并优化了软骨藻酸的ic-ELISA检测法:确定了包被抗原及抗体最佳工作浓度分别为6400倍和800倍,包被抗原浓度为0.99μg/mL。二抗最佳使用浓度为稀释3000倍。最佳封闭液为1% PVA,封闭时间为2 h。最佳一抗温育条件和最佳二抗温育条件是使用含4% PEG的抗体稀释液,37℃温育1 h。4.在10 ng/mL~10μg/mL范围内绘制了间接竞争ELISA的标线,线性回归方程为y=109.40-15.45x,相关系数R2为0.9682,最低检测限约为18 ng/mL。5.采用HPLC-UVD法分析了市售三种贝类样品,均无DA检出,定容前加标回收率为68.0% ~ 84.0%,匀浆前加标率略低,表明样品的前处理可能对低剂量加标的回收率有影响。6.采用所建立的ic-ELISA法对比分析上述三种贝类样品,均无DA检出,定容前加标回收率为53.0% ~ 63.2%,RSD为8.5% ~ 11.8%。匀浆前加标回收率为47.2% ~ 94.2%,RSD为12.3% ~ 17.0%。不同基质测得的回收率有一定差异。7.分析了两种方法检测贝类的相关性,相关系数为r = 0.6375,两者的检测结果有一定的相关性,但是ic-ELISA法测定的结果低于HPLC-UVD法的测定结果。