论文部分内容阅读
细胞自噬(简称自噬)是植物、动物和真菌等真核生物中高度保守的重要生物学过程，它在营养缺乏、环境胁迫、癌症和神经退行性疾病等多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。自噬过程起始于双层膜结构的自噬体的形成，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬体包裹的待降解物被投递到溶酶体中发生降解和消化，最终产物被细胞回收进而再次利用。
纳米材料是一维或者三维空间内尺度在1-100nm之间的特殊材料的统称。已有研究表明，多种纳米材料如量子点、金属氧化物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和纳米富勒烯及其衍生物等均具有诱导自噬激活的能力。主流观点认为，纳米颗粒引发的自噬效应是纳米材料的主要细胞毒性反应之一，这在一定范围内限制了纳米材料在生物医学上的应用。目前，领域内的研究主要集中在可诱导自噬激活的纳米材料的发现，以及调控自噬效应的纳米材料的设计和优化，纳米材料如何调控细胞内的重要信号通路从而激活自噬的分子机制仍有待研究。
蛋白激酶是细胞信号通路中的重要调控因子，通过磷酸化修饰自噬核心分子ATG(Autophagy-related)和自噬调控因子参与调控自噬过程。蛋白激酶是否在纳米颗粒诱导的自噬过程中发挥重要作用尚不清楚。本研究以二氧化硅纳米颗粒(Silica nanoparticles, SiNPs)诱导自噬激活过程为研究对象，结合下一代测序技术、蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量技术、生物信息学预测方法以及分子、细胞和生化等实验手段，系统鉴定和定量大鼠肾上皮(Normal rat kidney, NRK)细胞株在纳米颗粒处理后的转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组，设计参与调控纳米材料诱导自噬激活的关键激酶预测方法，预测并发现两个新的参与调控自噬的重要激酶，揭示了磷酸化调控纳米颗粒诱导自噬激活过程的分子作用机制，为纳米材料在生物医学上的应用与优化提供了有价值的参考信息。本研究的具体研究过程如下：
(1)本研究探究了三种不同尺度二氧化硅纳米颗粒的理化性质，发现不同尺寸的二氧化硅纳米颗粒在水相中均具有良好的分散性且分散均匀，在水相和近生理环境中均表现出了良好的稳定性。这一结果表明合成的纳米颗粒具有良好的水溶性和均一性。随后使用不同尺寸、不同浓度的纳米颗粒处理NRK-GFP-LC3稳转细胞株，利用荧光共聚焦显微镜观察到三种二氧化硅纳米颗粒均能增加细胞内GFP-LC3聚点数量，且高浓度的纳米颗粒处理具有更强的诱导效应。利用免疫印迹实验检测不同规格的二氧化硅纳米颗粒处理NRK细胞株后的LC3-II蛋白变化，发现16nm的二氧化硅纳米颗粒显著增加细胞内LC3-II蛋白表达水平。基于荧光标记的二氧化硅纳米颗粒(SiNPs fluorescently labelled with rhodamine，rSiNPs)与NRK-GFP-LC3稳转细胞株的共定位成像以及电子显微镜的拍照结果，发现二氧化硅纳米颗粒在自噬激活后被自噬体吞噬，随后与溶酶体发生融合。由此得出结论，二氧化硅纳米颗粒可以诱导自噬激活并促进自噬体形成，其诱导效应具有尺寸和浓度的依赖性特点。
(2)研究中进一步检测了纳米材料处理前后细胞中SQSTM1(Sequestosome 1)蛋白质的表达水平，发现处理后细胞中的SQSTM1蛋白质的含量显著上调，表明纳米颗粒抑制自噬流。这一结果在mRFP-GFP-LC3自噬双标记指示实验中得到了进一步的验证。此外，将自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine)和CQ(Chloroquine)分别加入到二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬激活的过程中，比较了LC3-II和SQSTM1的蛋白表达在处理前后的变化，探讨了3-MA和CQ对细胞自噬流的影响。综合以上实验结果，得出高浓度的二氧化硅纳米颗粒通过抑制溶酶体降解从而有效地阻断自噬流并促进自噬体积累的结论。
(3)本研究认为参与调控纳米材料诱导自噬激活的蛋白激酶，可能在转录、蛋白质、磷酸化或激酶活性层面发生显著变化。因此，本文利用16nm的二氧化硅纳米颗粒按时间梯度处理NRK细胞株，使用新一代测序技术、非标记定量蛋白质组技术和非标记定量磷酸化蛋白质组技术分别鉴定细胞样品中的基因转录水平、蛋白质表达量和磷酸化位点及其修饰水平。本研究设计了基于多组学数据整合的关键自噬调控激酶预测方法，系统分析自噬过程中激酶在不同组学层次上的变化，综合考虑激酶状态的改变和激酶已知的生物学功能，最后预测到21个潜在参与纳米材料诱导自噬激活的激酶。
(4)本研究随后对预测结果进行了实验验证及功能研究。首先，利用siRNA文库对21个潜在激酶基因进行功能筛选，借助免疫印迹实验探究纳米颗粒处理条件下敲低激酶基因对LC3-Ⅱ蛋白表达水平的影响，发现蛋白激酶CDK4和CDK7可能参与调控自噬。后续检测表明CDK4和CDK7的蛋白总量和磷酸化水平在纳米颗粒诱导自噬激活的过程中发生了显著变化。在激酶基因敲低情况下，用普通纳米材料和荧光标记的纳米材料处理NRK-GFP-LC3稳转细胞株，通过荧光共聚焦显微镜观察到细胞内GFP-LC3聚点数均呈现显著降低。此外，本研究还在两种人类癌症细胞株HeLa和HepG2中开展进一步验证，得到了一致性的结果。本文将自噬抑制剂CQ加入到激酶基因敲低实验中，揭示CDK4和CDK7的调控功能主要发生在自噬前期而不是后期。随后将CDK4的特异抑制剂ON123300、CDK7的特异抑制剂THZ1和自噬抑制剂CQ分别加入到二氧化硅纳米颗粒诱导自噬激活的过程中，结果发现抑制CDK4和CDK7可以抑制纳米材料诱导自噬过程中LC3-Ⅱ蛋白质表达水平和GFP-LC3亮斑的聚积。上述结果表明蛋白激酶CDK4和CDK7是参与二氧化硅纳米颗粒诱导自噬激活过程中的重要激酶。
(5)通过探究自噬激活剂依托泊苷、双氧水和衣霉素对自噬的影响，研究发现二氧化硅纳米颗粒引起细胞的多种胁迫压力对CDK4和CDK7的激活都可能有贡献。
总体来说，本文以二氧化硅纳米颗粒诱导自噬激活过程为研究对象，以大鼠肾上皮细胞株作为研究自噬信号通路的细胞模型，结合下一代基因测序技术、蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量技术、生物信息学预测方法以及分子、细胞和生化等实验手段，系统鉴定并定量大鼠肾上皮细胞株在纳米材料处理前后的转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组，设计和建立参与调控自噬的关键激酶预测方法，预测并发现纳米颗粒诱导细胞自噬激活的重要激酶，揭示了磷酸化参与调控该过程的分子机制，为纳米材料的安全应用与优化提供了重要的参考信息。
纳米材料是一维或者三维空间内尺度在1-100nm之间的特殊材料的统称。已有研究表明，多种纳米材料如量子点、金属氧化物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和纳米富勒烯及其衍生物等均具有诱导自噬激活的能力。主流观点认为，纳米颗粒引发的自噬效应是纳米材料的主要细胞毒性反应之一，这在一定范围内限制了纳米材料在生物医学上的应用。目前，领域内的研究主要集中在可诱导自噬激活的纳米材料的发现，以及调控自噬效应的纳米材料的设计和优化，纳米材料如何调控细胞内的重要信号通路从而激活自噬的分子机制仍有待研究。
蛋白激酶是细胞信号通路中的重要调控因子，通过磷酸化修饰自噬核心分子ATG(Autophagy-related)和自噬调控因子参与调控自噬过程。蛋白激酶是否在纳米颗粒诱导的自噬过程中发挥重要作用尚不清楚。本研究以二氧化硅纳米颗粒(Silica nanoparticles, SiNPs)诱导自噬激活过程为研究对象，结合下一代测序技术、蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量技术、生物信息学预测方法以及分子、细胞和生化等实验手段，系统鉴定和定量大鼠肾上皮(Normal rat kidney, NRK)细胞株在纳米颗粒处理后的转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组，设计参与调控纳米材料诱导自噬激活的关键激酶预测方法，预测并发现两个新的参与调控自噬的重要激酶，揭示了磷酸化调控纳米颗粒诱导自噬激活过程的分子作用机制，为纳米材料在生物医学上的应用与优化提供了有价值的参考信息。本研究的具体研究过程如下：
(1)本研究探究了三种不同尺度二氧化硅纳米颗粒的理化性质，发现不同尺寸的二氧化硅纳米颗粒在水相中均具有良好的分散性且分散均匀，在水相和近生理环境中均表现出了良好的稳定性。这一结果表明合成的纳米颗粒具有良好的水溶性和均一性。随后使用不同尺寸、不同浓度的纳米颗粒处理NRK-GFP-LC3稳转细胞株，利用荧光共聚焦显微镜观察到三种二氧化硅纳米颗粒均能增加细胞内GFP-LC3聚点数量，且高浓度的纳米颗粒处理具有更强的诱导效应。利用免疫印迹实验检测不同规格的二氧化硅纳米颗粒处理NRK细胞株后的LC3-II蛋白变化，发现16nm的二氧化硅纳米颗粒显著增加细胞内LC3-II蛋白表达水平。基于荧光标记的二氧化硅纳米颗粒(SiNPs fluorescently labelled with rhodamine，rSiNPs)与NRK-GFP-LC3稳转细胞株的共定位成像以及电子显微镜的拍照结果，发现二氧化硅纳米颗粒在自噬激活后被自噬体吞噬，随后与溶酶体发生融合。由此得出结论，二氧化硅纳米颗粒可以诱导自噬激活并促进自噬体形成，其诱导效应具有尺寸和浓度的依赖性特点。
(2)研究中进一步检测了纳米材料处理前后细胞中SQSTM1(Sequestosome 1)蛋白质的表达水平，发现处理后细胞中的SQSTM1蛋白质的含量显著上调，表明纳米颗粒抑制自噬流。这一结果在mRFP-GFP-LC3自噬双标记指示实验中得到了进一步的验证。此外，将自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine)和CQ(Chloroquine)分别加入到二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬激活的过程中，比较了LC3-II和SQSTM1的蛋白表达在处理前后的变化，探讨了3-MA和CQ对细胞自噬流的影响。综合以上实验结果，得出高浓度的二氧化硅纳米颗粒通过抑制溶酶体降解从而有效地阻断自噬流并促进自噬体积累的结论。
(3)本研究认为参与调控纳米材料诱导自噬激活的蛋白激酶，可能在转录、蛋白质、磷酸化或激酶活性层面发生显著变化。因此，本文利用16nm的二氧化硅纳米颗粒按时间梯度处理NRK细胞株，使用新一代测序技术、非标记定量蛋白质组技术和非标记定量磷酸化蛋白质组技术分别鉴定细胞样品中的基因转录水平、蛋白质表达量和磷酸化位点及其修饰水平。本研究设计了基于多组学数据整合的关键自噬调控激酶预测方法，系统分析自噬过程中激酶在不同组学层次上的变化，综合考虑激酶状态的改变和激酶已知的生物学功能，最后预测到21个潜在参与纳米材料诱导自噬激活的激酶。
(4)本研究随后对预测结果进行了实验验证及功能研究。首先，利用siRNA文库对21个潜在激酶基因进行功能筛选，借助免疫印迹实验探究纳米颗粒处理条件下敲低激酶基因对LC3-Ⅱ蛋白表达水平的影响，发现蛋白激酶CDK4和CDK7可能参与调控自噬。后续检测表明CDK4和CDK7的蛋白总量和磷酸化水平在纳米颗粒诱导自噬激活的过程中发生了显著变化。在激酶基因敲低情况下，用普通纳米材料和荧光标记的纳米材料处理NRK-GFP-LC3稳转细胞株，通过荧光共聚焦显微镜观察到细胞内GFP-LC3聚点数均呈现显著降低。此外，本研究还在两种人类癌症细胞株HeLa和HepG2中开展进一步验证，得到了一致性的结果。本文将自噬抑制剂CQ加入到激酶基因敲低实验中，揭示CDK4和CDK7的调控功能主要发生在自噬前期而不是后期。随后将CDK4的特异抑制剂ON123300、CDK7的特异抑制剂THZ1和自噬抑制剂CQ分别加入到二氧化硅纳米颗粒诱导自噬激活的过程中，结果发现抑制CDK4和CDK7可以抑制纳米材料诱导自噬过程中LC3-Ⅱ蛋白质表达水平和GFP-LC3亮斑的聚积。上述结果表明蛋白激酶CDK4和CDK7是参与二氧化硅纳米颗粒诱导自噬激活过程中的重要激酶。
(5)通过探究自噬激活剂依托泊苷、双氧水和衣霉素对自噬的影响，研究发现二氧化硅纳米颗粒引起细胞的多种胁迫压力对CDK4和CDK7的激活都可能有贡献。
总体来说，本文以二氧化硅纳米颗粒诱导自噬激活过程为研究对象，以大鼠肾上皮细胞株作为研究自噬信号通路的细胞模型，结合下一代基因测序技术、蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量技术、生物信息学预测方法以及分子、细胞和生化等实验手段，系统鉴定并定量大鼠肾上皮细胞株在纳米材料处理前后的转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组，设计和建立参与调控自噬的关键激酶预测方法，预测并发现纳米颗粒诱导细胞自噬激活的重要激酶，揭示了磷酸化参与调控该过程的分子机制，为纳米材料的安全应用与优化提供了重要的参考信息。