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Avenin-likeb蛋白是属于醇溶蛋白超家族的非典型储藏蛋白。目前已明确该蛋白可正向影响小麦的加工品质,但其作用机理尚不清楚,因此育种利用价值受到限制。Avenin-likeb蛋白含有18或19个Cysteine残基,高含量的Cys残基不仅可以形成分子内二硫键稳定蛋白结构,而且为该蛋白通过分子间二硫键参与麦谷蛋白聚合体形成,进而影响小麦加工品质提供了可能性。该蛋白中间重复区Cys残基位置保守,而N-端和C-端的Cys残基具有非保守性,即来源于不同小麦品种和祖先物种的Avenin-likeb蛋白在该位置是否出现Cys残基,表现出变异。推测位置不保守的Cys残基更有可能形成分子间二硫键。本文研究Avenin-likeb蛋白特定位置非保守性Cys残基对小麦面团弹性的影响与作用机制,获得以下主要结果:
(1)通过人工定点突变,将avenin-likeb基因C-端非保守Cys残基位点处的Tyr密码子替换为Cys密码子,并通过基因枪法将mutavenin-likeb和wtavenin-likeb基因转入小麦品种ZM9023中;经连续六代(T0-T5)的筛选,分别获得4株和2株过表达mutavenin-likeb和wtavenin-likeb基因且表达水平相近的转基因纯合株系。
(2)对面粉品质特征参数和揉混特性的分析显示,外源基因的过表达,显著提高了转基因株系的面筋含量、SDS沉降值、面筋强度和面团抗拉伸特性。然而,转mutavenin-likeb基因株系的上述品质参数都低于转wtavenin-likeb基因株系。
(3)对外源Mut/WTAvenin-likeb蛋白对面粉/GMPgel的蛋白分子量分布、麦谷蛋白大聚体(GMP)粒径分布以及面筋蛋白显微结构的影响进行分析。结果显示Mut/WTAvenin-likeb蛋白都显著增加了大分子蛋白聚合体含量及GMP颗粒平均粒径,表明Mut/WTAvenin-likeb蛋白可以增强面筋蛋白的交联聚合程度,使其网络结构更为紧密和均匀。但是,相较于MutAvenin-likeb蛋白WTAvenin-likeb蛋白则更有利于面筋蛋白的交联聚合。
(4)转基因株系面团中SS含量显著增加,表明Mut/WTAvenin-likeb蛋白中Cys残基可形成分子间二硫键,促进麦谷蛋白亚基形成大聚合体。转基因株系面筋蛋白二级构象randomcoil向intermolecularβ-sheet的转换,表明Mut/WTAvenin-likeb蛋白的过表达有利于面筋蛋白有序折叠聚合。但是,mutavenin-likeb转基因株系面团SS含量及面筋蛋白二级构象randomcoil向intermolecularβ-sheet转换的比例,都低于wtavenin-likeb转基因株系。
Avenin-likeb蛋白特定位点的Cys残基可形成分子间二硫键,增强亚基间的交联程度,有利于麦谷蛋白聚合以形成致密有序的面筋网络结构,从而提高面筋弹性与强度,改善面粉加工品质。然而,推测MutAvenin-likeb蛋白由于C-端额外Cys残基与位置毗邻的原本形成分子间二硫键的Cys残基形成分子内二硫键,从而对面粉加工品质产生不同的影响效应。
(1)通过人工定点突变,将avenin-likeb基因C-端非保守Cys残基位点处的Tyr密码子替换为Cys密码子,并通过基因枪法将mutavenin-likeb和wtavenin-likeb基因转入小麦品种ZM9023中;经连续六代(T0-T5)的筛选,分别获得4株和2株过表达mutavenin-likeb和wtavenin-likeb基因且表达水平相近的转基因纯合株系。
(2)对面粉品质特征参数和揉混特性的分析显示,外源基因的过表达,显著提高了转基因株系的面筋含量、SDS沉降值、面筋强度和面团抗拉伸特性。然而,转mutavenin-likeb基因株系的上述品质参数都低于转wtavenin-likeb基因株系。
(3)对外源Mut/WTAvenin-likeb蛋白对面粉/GMPgel的蛋白分子量分布、麦谷蛋白大聚体(GMP)粒径分布以及面筋蛋白显微结构的影响进行分析。结果显示Mut/WTAvenin-likeb蛋白都显著增加了大分子蛋白聚合体含量及GMP颗粒平均粒径,表明Mut/WTAvenin-likeb蛋白可以增强面筋蛋白的交联聚合程度,使其网络结构更为紧密和均匀。但是,相较于MutAvenin-likeb蛋白WTAvenin-likeb蛋白则更有利于面筋蛋白的交联聚合。
(4)转基因株系面团中SS含量显著增加,表明Mut/WTAvenin-likeb蛋白中Cys残基可形成分子间二硫键,促进麦谷蛋白亚基形成大聚合体。转基因株系面筋蛋白二级构象randomcoil向intermolecularβ-sheet的转换,表明Mut/WTAvenin-likeb蛋白的过表达有利于面筋蛋白有序折叠聚合。但是,mutavenin-likeb转基因株系面团SS含量及面筋蛋白二级构象randomcoil向intermolecularβ-sheet转换的比例,都低于wtavenin-likeb转基因株系。
Avenin-likeb蛋白特定位点的Cys残基可形成分子间二硫键,增强亚基间的交联程度,有利于麦谷蛋白聚合以形成致密有序的面筋网络结构,从而提高面筋弹性与强度,改善面粉加工品质。然而,推测MutAvenin-likeb蛋白由于C-端额外Cys残基与位置毗邻的原本形成分子间二硫键的Cys残基形成分子内二硫键,从而对面粉加工品质产生不同的影响效应。